Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được >100 triệu tế bào trong 1 mL dung dịch lên men. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thu chất dinh dưỡng rất mạnh.
Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men sau đó khuếch tán qua màng tế bào vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành.
Rưoự ethylic tạo thành khuếch tán ra môi truờng bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào trong môi trường, CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn. Ở áp suất 800mmHg, nhiệt độ 25 – 30°C là 0,857 – 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước. Vì thế, CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng đạt
thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diển ra nhanh hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men. Quá trình tế bào nấm men nổi lên rồi chìm xuống diễn ra liên tục làm cho nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang thái động, gia tăng khả năng tiếp xúc của tế bào với môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diển ra nhanh hơn, gia tăng tốc độ lên men (Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc, 2004).
Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lững khác hiện diện trong dịch lên men điều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men.
Trong giai đoạn lên men phụ, sự đường hóa cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hòa tan. Do đó, tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào khả năng thủy phân hàm lượng dextrin (không lên men) còn lại. Như vậy, chu kì lên men dịch đường phụ thuộc vào thời gian lên men cuối hay phụ thuộc vào khả năng đường hóa của phức hệ enzyme amylase. Rất nhiều thí nghiệm cho thấy rằng càng kéo dài thời gian lên men cuối thì hiệu suất quá trình lên men càng tăng.
2.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men ethanol của nấm men
– Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng
Nguyên liệu chính của quá trình lên men là glucid, nên nồng độ đường ảnh hưởng lớn đến hiệu suất lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ đường phù hợp từ 10 – 15%. Nồng độ đường quá cao sẽ ức chế nấm men và năng lực lên men rượu giảm. Khi nồng độ đường 30 – 35% sự lên men gần như đình chỉ. Nếu nồng độ đường quá thấp, khả năng lên men cũng giảm.
– Dinh dƣỡng
Nitơ và nguồn carbon là yếu tố dinh dưỡng chính trong môi trường lên men. Sự
tương tác lẫn nhau của các chất dinh dưỡng có thể đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Các chất bổ sung vào môi trường sinh trưởng có chứa maltose hoặc glucose cùng với nguồn nitơ như peptone sẽ làm tăng sinh khối và sự sản sinh ethanol (Helena de Cruz et al., 2003).
– Ảnh hƣởng của oxy
Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Trong điều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men đường tạo thành rượu và CO2, còn trong điều kiện đầy đủ oxy nấm men có khả năng oxy hóa đường thành rượu và CO2 và tăng sinh khối. “Hiệu ứng Pastuer” kìm hãm sự lên men rượu bằng oxy. Oxy là thành phần không thể thiếu được ở giai đoạn phát triển sinh khối. Tùy nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai đoạn chế biến còn lại. Với sự có mặt của oxy nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối. Trong giai đoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyde, sản phẩm rất dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi khuẩn acid lactic, acid acetic,…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia là môi trường rất giàu chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển.
Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ lượng oxy cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ lượng tế bào lên men ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và dây chuyền sản xuất. Tuy nhiên lại có một số nấm men phát triển nhanh và tạo ra hàm lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trường ban đầu có đầy đủ oxy (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002).
– Ảnh hƣởng của CO2
Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh sự sinh sản của nấm men rượu. Oxy như là một chất trao đổi, trong nồng độ xác định nó có tác dụng kìm hãm hoặc làm ngừng sinh sản của nấm men. Theo nghiên cứu của Miuler– Thurrau, khi: Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt 0,25% trọng lượng thì việc sinh sản của nấm men đình trệ. Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt 1,5% trọng lượng thì nấm men không còn sinh sản được nữa (Bùi Ái, 2003).
Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với dòng ưa nhiệt trung bình, thì nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối là 35°C và nhiệt độ thích hợp cho sự lên men là 40°C. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28 – 32°C. Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Nếu làm lạnh dịch đường từ 20 – 22°C sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn. Sau 8 – 10 giờ, nhiệt độ lên men sẽ tăng lên 28 – 30°C. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại, sản phẩm tạo nhiều ester và aldehyde. Ở nhiệt độ 30oC, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2 đến 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 – 38°C chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
Nhiệt độ là yếu tố cần thiết ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của nấm men. Thông thường nhiệt độ phù hợp cho lên men là 28 – 30°C. Nhiệt độ khoảng hơn 50°C và dưới 0°C thì sự lên men hầu như bị đình trệ. Thông thường quá trình lên men ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài hơn, nhưng lên men ở nhiệt độ quá cao sẽ làm tổn thất sản phẩm, cũng như ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm.
– Ảnh hƣởng của pH
Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH 2,0 – 8,0 nhưng thích hợp nhất là 4,0 – 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH từ 3,8 – 4,0. Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần (thuần hoá) với độ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng. Khi pH đạt 8,0 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động của nấm men.
Nồng độ của ion H+
có ảnh hưởng đáng kể đến sự lên men trong công nghiệp do pH đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi khuẩn có thể bị nhiễm và ảnh
động ở pH 4,5 – 4,7. Khi pH được điều chỉnh lên 7,0 hoặc cao hơn thì acid acetic được tạo thành từ acetaldehyde dựa vào sự gia tăng hoạt động của enzyme aldehyde dehydrogenase, glycerol được sản sinh và ức chế sự lên men (Wang et al., 2001).
– Ảnh hƣởng nồng độ ethanol
Nồng độ ethanol cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men, nồng độ ethanol cao có thể ức chế khả năng sinh sản tế bào và khả năng sống sót của nấm men. Rượu tạo ra trong quá trình lên men có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình lên men. Sản phẩm chủ yếu của quá trình kị khí là ethanol, ethanol kìm hãm hoạt động của tế bào nấm men, tuy nhiên tùy theo nồng độ. Thông thường, nấm men lên men đến nồng độ rượu đạt 12 – 14%. Một số ít nấm men có thể lên men đạt nồng độ rượu 17 – 20%. Với nồng độ rượu cao hơn sẽ ức chế nấm men và kìm hãm lên men rượu.Việc chọn lọc dòng nấm men có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao sẽ mang lại lợi ích đáng kể cho quá trình lên men vì các dòng nấm men này có thể nâng cao hiệu suất của quá trình lên men.
Ngô Thị Phương Dung (2009) đã phân lập được 50 dòng nấm men từ viên men rượu, chín dòng được chọn để khảo sát khả năng chịu độ cồn. Kết quả thử khả năng chịu đựng độ cồn cho thấy bảy dòng có khả năng chịu độ cồn trong khoảng 5 – 6% (w/v) ethanol và hai dòng có khả năng chịu độ cồn thấp hơn từ 2,4 – 3,0% (w/v) ethanol.
– Ảnh hƣởng nồng độ dịch lên men
Nồng độ dịch lên men được xác định bằng khối lượng đường sucrose trong dung dịch (độ Brix). Nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm thay đổi độ nhớt của môi trường tăng áp suất dẫn đến mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Nồng độ ethanol được sản sinh tăng cao cũng gây ức chế nấm men. Tuy nhiên nếu nồng độ dịch đường quá thấp thì sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất lên men, hao phí trong quá trình chưng cất.
Nấm men chỉ có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ thích hợp từ 10 – 18%, nồng độ đường quá cao sẽ ức chế nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng độ đường 30 – 35%, nồng độ đường thấp quá cũng làm giảm năng lực lên men.
CHƢƠNG 3
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phƣơng tiện thí nghiệm 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013.
3.1.3 Nguyên vật liệu
– Dịch rỉ đường.
– Bốn dòng nấm men phân lập từ Lào (Trung tâm nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Lên men sản phẩm Nông nghiệp, Khoa Công nghệ, Trường Đại học Khon Kaen, Thái Lan).
3.1.4. Dụng cụ, thiết bị
– Buồng đếm hồng cầu
– Cân phân tích (Ohaus Corp, ARA520, Mỹ)
– Kính hiển vi quang học (Olympus Optical, BH–2, Nhật) – Máy vortex (HEIPOLPH, Đức)
– Nồi thanh trùng (Breukelen, Hà Lan) – Tủ cấy (Totelstar Bio–II–A, Tây Ban Nha) – Tủ ủ (Henrich, Đức)
– Water bath & Shaker (GESELLSCHAFT, Đức)
– Các dụng cụ thông dụng như: ống nghiệm, pipet, bình tam giác, ống đong…
3.1.5 Hóa chất a) Môi trƣờng a) Môi trƣờng
– Môi trường YM agar: 0,3% yeast extract, 0,3% malt extract, 1% D-glucose, 0,5% peptone, 1,5% agar
b) Các hóa chất khác
C2H5OH, NaCl, NaHSO3 , NaOH, HCl,…
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của các dòng nấm men
Mục đích: Tuyển chọn những dòng nấm men có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao.
Phƣơng pháp tiến hành
– Thí nghiệm 2 nhân tố (dòng nấm men và nhiệt độ) với 3 lần lặp. – Cấy ria 4 dòng nấm men trên đĩa petri có chứa môi trường YPD agar.
– Ủ các đĩa petri ở các nhiệt độ khác nhau: 40, 43, 45, 47 và 49°C từ 1 đến 4 ngày.
– Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các dòng nấm men khác nhau trên thạch. Chỉ có các dòng nấm men chịu nhiệt mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc ở nhiệt độ cao.
– Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển tốt thành khuẩn lạc to, tròn của các dòng nấm men ở điều kiện nhiệt độ cao trong thời gian từ 1 đến 4 ngày.
– Tuyển chọn những dòng nấm men có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao.
3.2.2. Thử nghiệm khả năng chịu ethanol của các dòng nấm men
Mục đích: Tuyển chọn những dòng nấm men phát triển tốt trong môi trường có ethanol.
Phƣơng pháp tiến hành
– Thí nghiệm 2 nhân tố (dòng nấm men và nồng độ ethanol) với 3 lần lặp.
– Cấy ria các dòng nấm men trên đĩa petri có chứa môi trường YPD agar có bổ sung ethanol tinh khiết các nồng độ khác nhau 0, 4, 8, 10, 12, 14 và 15 %.
– Ủ các đĩa petri ở nhiệt độ 30ºC từ 1 đến 4 ngày.
– Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các dòng nấm men khác nhau trên thạch. Chỉ có các dòng nấm men chịu ethanol mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường có nồng độ ethanol cao.
– Tuyển chọn những dòng nấm men có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ ethanol cao.
3.2.3. Khảo sát khả năng lên men đƣờng glucose của các dòng nấm men đã đƣợc tuyển chọn
Mục đích: Tuyển chọn các dòng nấm men có khả năng lên men mạnh bằng phương pháp lên men dung dịch đường glucose 2% trong ống Durham.
Phƣơng pháp tiến hành
– Thí nghiệm 1 nhân tố (dòng nấm men) 3 lần lặp.
– Chuẩn bị men giống: Nuôi sinh khối nấm men trong 24 giờ.
– Chủng men giống: Lấy 1 mL dung dịch chứa tế bào nấm men vào ống Durham có chứa 9 mL dung dịch glucose 2% đã được khử trùng ở 115ºC trong 10 phút. Lắc thật đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược chiều cao 30 mm, ủ ở nhiệt độ phòng.
– Chỉ tiêu đánh giá: chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược tại các thời điểm 4, 8, 12, 16, 20 và 24 giờ ủ.
– Chọn lọc những dòng nấm men có khả năng lên men nhanh và mạnh.
3.2.4. Khảo sát khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao của các dòng nấm men đã đƣợc tuyển chọn
Mục đích: Tuyển chọn những dòng nấm men có khả năng tạo ethanol cao ở nhiệt độ cao.
Phƣơng pháp tiến hành:
– Thí nghiệm 2 nhân tố (dòng nấm men và nhiệt độ) với 3 lần lặp lại.
– Nuôi cấy nấm men trong môi trường nuôi sinh khối đến khi mật số tế bào nấm men đạt 108
tế bào/mL.
– Cho 99 mL dung dịch rỉ đường nồng độ 20°Brix vào bình tam giác 250 mL, khử trùng ở 115°C trong 10 phút.
– Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác, mật số nấm men sau khi chủng là 106 tế bào/mL.