Mục đích: Tuyển chọn những dòng nấm men phát triển tốt trong môi trường có ethanol.
Phƣơng pháp tiến hành
– Thí nghiệm 2 nhân tố (dòng nấm men và nồng độ ethanol) với 3 lần lặp.
– Cấy ria các dòng nấm men trên đĩa petri có chứa môi trường YPD agar có bổ sung ethanol tinh khiết các nồng độ khác nhau 0, 4, 8, 10, 12, 14 và 15 %.
– Ủ các đĩa petri ở nhiệt độ 30ºC từ 1 đến 4 ngày.
– Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các dòng nấm men khác nhau trên thạch. Chỉ có các dòng nấm men chịu ethanol mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường có nồng độ ethanol cao.
– Tuyển chọn những dòng nấm men có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ ethanol cao.
3.2.3. Khảo sát khả năng lên men đƣờng glucose của các dòng nấm men đã đƣợc tuyển chọn
Mục đích: Tuyển chọn các dòng nấm men có khả năng lên men mạnh bằng phương pháp lên men dung dịch đường glucose 2% trong ống Durham.
Phƣơng pháp tiến hành
– Thí nghiệm 1 nhân tố (dòng nấm men) 3 lần lặp.
– Chuẩn bị men giống: Nuôi sinh khối nấm men trong 24 giờ.
– Chủng men giống: Lấy 1 mL dung dịch chứa tế bào nấm men vào ống Durham có chứa 9 mL dung dịch glucose 2% đã được khử trùng ở 115ºC trong 10 phút. Lắc thật đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược chiều cao 30 mm, ủ ở nhiệt độ phòng.
– Chỉ tiêu đánh giá: chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược tại các thời điểm 4, 8, 12, 16, 20 và 24 giờ ủ.
– Chọn lọc những dòng nấm men có khả năng lên men nhanh và mạnh.
3.2.4. Khảo sát khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao của các dòng nấm men đã đƣợc tuyển chọn
Mục đích: Tuyển chọn những dòng nấm men có khả năng tạo ethanol cao ở nhiệt độ cao.
Phƣơng pháp tiến hành:
– Thí nghiệm 2 nhân tố (dòng nấm men và nhiệt độ) với 3 lần lặp lại.
– Nuôi cấy nấm men trong môi trường nuôi sinh khối đến khi mật số tế bào nấm men đạt 108
tế bào/mL.
– Cho 99 mL dung dịch rỉ đường nồng độ 20°Brix vào bình tam giác 250 mL, khử trùng ở 115°C trong 10 phút.
– Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác, mật số nấm men sau khi chủng là 106 tế bào/mL.
nhau: nhiệt độ phòng, 35, 40 và 45ºC. Đếm số bọt khí sinh ra trong 2 phút sau mỗi 24 giờ.
– Chưng cất để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được, quy về nồng độ ethanol ở 20ºC.
– Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men tạo ethanol ở các nhiệt độ khác nhau: Nồng độ ethanol thu được sau lên men. Tuyển chọn các dòng nấm men cho nồng độ ethanol cao ở nhiệt độ cao.
3.2.5. Khảo sát các điều kiện lên men ethanol ở nhiệt độ cao của dòng nấm men đã tuyển chọn
3.2.5.1. Ảnh hƣởng của mật số giống chủng và nồng độ đƣờng
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của mật số giống chủng và nồng độ đường lên khả năng lên men tạo ethanol của các dòng nấm men.
Phƣơng pháp tiến hành
– Thí nghiệm 2 nhân tố (mật số giống chủng và nồng độ đường) với 3 lần lặp. – Nuôi sinh khối nấm men tuyển chọn từ thí nghiệm 3.2.3 trong môi trường PGY đến khi mật số tế bào nấm men đạt 106, 107 và 108 tế bào/mL.
– Cho 99 mL dung dịch rỉ đường ở 4 độ Brix khác nhau: 15, 20, 25 và 30ºBrix vào bình tam giác 250 mL, khử trùng ở 115ºC trong 10 phút.
– Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác 250 mL, mật số nấm men sau khi chủng lần lượt là 104
, 105 và 106 tế bào/mL.
– Ủ 5 – 7 ngày trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock) ở nhiệt độ được chọn từ thí nghiệm 3.2.4. Đếm bọt khí sinh ra trong 2 phút sau mỗi 24 giờ.
– Sau thời gian ủ, đem chưng cất dịch lên men để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được, quy về nồng độ ethanol ở 20ºC.
– Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men tạo ethanol ở các mật số giống chủng và nồng độ đường khác nhau: Nồng độ ethanol thu được sau lên men, hàm lượng đường sử dụng.
3.2.5.2. Ảnh hƣởng của thời gian lên men và pH môi trƣờng
Mục đích: Khảo sát khả năng lên men của nấm men ở các môi trường có giá trị pH khác nhau và thời gian lên men.
Phƣơng pháp tiến hành
– Thí nghiệm 2 nhân tố (pH môi trường và thời gian lên men) với 3 lần lặp lại. – Nuôi sinh khối các dòng nấm men tuyển chọn từ thí nghiệm 3.2.3 trong môi trường PGY điều chỉnh cho mật số tế bào nấm men thích hợp (chọn từ thí nghiệm 3.2.5.1).
– Cho 99 mL dung dịch rỉ đường có nồng độ đường thích hợp (được chọn từ thí nghiệm 3.2.5.1) vào bình tam giác 250 mL. Điều chỉnh giá trị pH ở các bình khác nhau: 4,0; 5,0; 6,0 và pH tự nhiên. Khử trùng các bình tam giác trên ở 115ºC trong 10 phút.
– Chủng nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác.
– Ủ 3, 5 và 7 ngày trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock) ở nhiệt độ được chọn từ thí nghiệm 3.2.4. Đếm bọt khí sinh ra trong 2 phút sau mỗi 24 giờ.
– Chưng cất để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được, quy về nồng độ ethanol ở 20ºC.
– Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men tạo ethanol ở các môi trường có giá trị pH và thời gian lên men khác nhau: Nồng độ ethanol thu được sau lên men, giá trị pH sau lên men.
Xử lý số liệu, phân tích thống kê
Số liệu được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2003 và Minitab 16.
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khả năng chịu nhiệt của các dòng nấm men
Khả năng sinh trưởng của 4 dòng nấm men ở các mức độ nhiệt độ khác nhau qua 1 – 4 ngày ủ được thể hiện qua Bảng 3.
Bảng 3. Khả năng chịu nhiệt của 4 dòng nấm men
STT Dòng nấm men Nhiệt độ khảo sát 40°C 42°C 43°C 45°C 47°C 49°C 1 L29–1 + + + – – – 2 L07–1 + + + + – – 3 P4 + + + – – – 4 L2b2 + + + + – –
Ghi chú: Dấu “+” có khuẩn lạc, dấu “–” không có khuẩn lạc
Sau 48 giờ cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng tất cả 4 dòng nấm men đều cho thấy khuẩn lạc phát triển ở các mức nhiệt độ 40, 42 và 43°C. Ở nhiệt độ 45°C có 2 dòng phát triển được là L07–1 và L2b2. Ở mức nhiệt độ 47°C và 49°C không có dòng nấm men nào có thể chịu đựng và phát triển để tạo khuẩn lạc sau 48 giờ ủ. Trong thí nghiệm này khi tăng nhiệt độ ủ lên càng cao thì khả năng tồn tại và phát triển của các dòng nấm men càng giảm xuống.
Kết quả thí nghiệm trên đã giúp chúng ta đánh giá được sơ bộ khả năng chịu nhiệt của 4 dòng nấm men. Cả 4 dòng đều phát triển ở nhiệt độ 43°C, ở nhiệt độ 45°C chỉ có 2 dòng phát triển và hình thành khuẩn lạc được là L07–1 và L2b2.
So sánh với khả năng chịu nhiệt của các dòng nấm men Thái Lan ( Nguyễn Ánh Dương, 2013) ta thấy những dòng nấm men này có khả năng phát triển ở nhiệt độ rất cao ( 45°C) nhiệt độ mà ít có dòng nấm men có khả năng chịu đựng được.
Đồng thời, khi so sánh khả năng phát triển ở nhiệt độ cao của nấm mem Lào với các dòng nấm men phân lập ở Việt Nam ( Nguyễn Hữu Tường, 2013) thấy rằng các dòng nấm men Lào chịu được nhiệt độ cao hơn các dòng nấm men phân lập ở Việt Nam ( chỉ phát triển được ở 43°C).
4.2. Khả năng chịu ethanol của 4 dòng nấm men
Khả năng sinh trưởng của 4 dòng nấm men ở môi trường có bổ sung nồng độ ethanol khác nhau sau 48 giờ ủ được thể hiện ở Bảng 4.
Bảng 4. Khả năng chịu ethanol của 4 dòng nấm men sau 48 giờ ủ
STT Dòng nấm men Nồng độ ethanol khảo sát
4% 8% 10% 12% 14% 15%
1 L29–1 + + + + + +
2 L07–1 + + + + + +
3 P4 + + + + + –
4 L2b2 + + + + + +
Ghi chú: Dấu “+” có khuẩn lạc,” –” không có khuẩn lạc
Sau 48 giờ cấy nấm men trong môi trường dinh dưỡng, tất cả các dòng nấm men đều phát triển trong môi trường có bổ sung 4, 8, 10, 12 và 14% ethanol. Ở mức 15% ethanol có 3 dòng có thể phát triển được và tạo khuẩn lạc là L29–1, L07–1 và L2b2. Nhìn chung 4 dòng nấm men này có khả năng chịu ethanol tương đối cao, chỉ có dòng P4 không phát triển ở nồng độ ethanol 15%. Khả năng chịu ethanol của các dòng nấm men cũng được xem là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng phát triển của các dòng nấm men, khi nồng độ ethanol quá cao sẽ ức chế sự phát triển và gây ngộ độc nấm men.
Thí nghiệm khảo sát khả năng chịu ethanol giúp đánh giá sơ bộ khả năng chịu ethanol của 4 dòng nấm men. Tất cả 4 dòng nấm men đều phát triển ở nồng độ ethanol bổ sung 4, 8, 10, 12, 14% và có 3 dòng phát triển ở nồng độ ethanol bổ sung 15% là L29–1, L07–1 và L2b2. L2b2 P4 15 % L07-1 L29-1 15% Hình 7. Khuẩn lạc của dòng L2b2, L07-1 và L29-1 ở môi trƣờng bổ sung 15% ethanol
So sánh khả năng chịu ethanol của các dòng nấm men Lào với Thái Lan ( Nguyễn Ánh Dương, 2013) và Việt Nam ( Nguyễn Hữu Tường, 2013) thấy rằng những dòng nấm men Lào Và Thái có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao (15%) trong khi đó các dòng nấm men phân lập ở Việt Nam chịu được nồng độ ethanol thấp hơn ( chỉ 12%).
4.3. Khả năng lên men đƣờng glucose của các dòng nấm men
Kết quả chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược ở các thời điểm 4, 8, 12, 16, 20 và 24 giờ được thể hiện trong Bảng 5.
Bảng 5. Khả năng lên men glucose của các dòng nấm men
STT Dòng nấm men Thời gian xuất hiện bọt khí Chiều cao cột khí CO2 (mm)
4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ 24 giờ 1 L29–1 2 3,67b 13,00b 18,00b 24,00c 26,33b 27,33b 2 L07–1 2 3,00b 15,00b 26,00a 27,67b 28,67a 30,00a 3 P4 2 15,33a 19,67a 28,67a 28,67ab 28,67a 28,67ab 4 L2b2 2 4,67b 17,67a 28,67a 30,00a 30,00a 30,00a
Ghi chú: Chiều cao tối đa của cột khí trong ống Durham là 30 mm. Giá trị trong bảng là giá trị trung
bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở cấp độ tin cậy 95%.
Phương pháp lên men đường glucose trong ống Durham giúp đánh giá sơ bộ khả năng lên men của bốn đòng nấm men.
Trong khoảng thời gian đầu sau khi chủng giống (khoảng 3 giờ đầu) đa số các dòng nấm men tăng sinh khối vì thế khả năng lên men của các dòng nấm men tương đối chậm. Dòng P4 có khả năng tăng sinh khối cũng như lên men tương đối nhanh chỉ khoảng sau 4 giờ chiều cao cột khí CO2 đạt giá trị cao nhất (15,33 mm) so với các dòng còn lại. Sau 8 giờ lên men dòng P4 tiếp tục đạt giá trị cao nhất về chỉ tiêu chiều cao cột khí CO2, tuy nhiên tốc độ lên men chỉ tương đối. Ba dòng nấm men còn lại có chỉ tiêu cột khí CO2thấp hơn nhưng tốc độ lên men rất nhanh. So sánh về mặt thống kê thì dòng L2b2 và P4 có khả năng lên men tương đương với nhau và khác biệt không có ý nghĩa sau 8 giờ lên men. Ở thời điểm 12 giờ lên men thì dòng L2b2 và P4 tiếp tục
tuy nhiên dòng P4 tốc độ lên men chậm hơn so với dòng L2b2. Dòng L29–1 có khả năng lên men tương đối chậm hơn so với các dòng còn lai. Sau 16 giờ thì dòng L2b2 đạt chỉ tiêu chiều cao cột khí CO2 cực đại (30 mm), riêng dòng P4 khả năng lên men dừng lại (chiều cao cột khí CO2 không tăng) ở thời điểm 16 giờ. Kết quả này có thể giải thích do nấm men đã sử dụng hết đường và các chất dinh dưỡng vì vậy dòng P4 không còn khả năng lên men tiếp tục. Dòng L29–1 và L07–1 vẫn tiếp tục lên men với tốc độ tương đối chậm. Đến thời điểm 24 giờ, chiều cao cột khí CO2 của dòng L07–1 đạt cực đại trong khi dòng P4 và L29–1 không đạt chỉ tiêu này. Tuy nhiên, khi so sánh giá trị chiều cao cột khí của dòng L2b2, L07–1 và P4 cho thấy 3 dòng này có khả năng lên men tương đương với nhau và không có khác biệt về mặt thống kê với độ tin cậy 95%.
Qua kết quả thí nghiệm trên ta thấy dòng L2b2 có khả năng lên men nhanh, mạnh và ổn định nhất so với ba dòng còn lại, dòng P4 có khả năng lên men nhanh tuy nhiên chỉ ở thời gian đầu từ 4 – 12 giờ, ở thời điểm từ 16 giờ thì khả năng lên men dừng lại và chiều cao cột khí CO2 không đạt giá trị cực đại sau 24 giờ lên men. Hai dòng L29–1 và L07–1 có tốc độ lên men tương đối nhanh và ổn định.
4.4 Khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao của các dòng nấm men
Khả năng sinh ethanol ở các mức nhiệt độ khác nhau của các dòng nấm men được thể hiện trong Hình 8.
Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Giá trị theo sau có các mẫu tự
giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%..
Nhìn chung ở các mức nhiệt độ tự nhiên (28 – 32°C) và 35°C các dòng nấm men sinh ethanol có nồng độ tương đương với nhau và khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Nồng độ ethanol ghi nhận đạt giá trị cao nhất ở 40°C (3,28 %w/v của dòng L2b2). Nhìn vào Hình 8 cho thấy, nồng độ ethanol có xu hướng giảm khi nhiệt độ ủ tăng lên. Cụ thể, dòng P4 và L29–1 ở mức nhiệt độ tự nhiên đến 35°C có tốc độ lên men tương đương với L2b2 và L07–1 và sản sinh ra nồng độ ethanol khác biệt không có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên khi nhiệt độ tăng lên 40°C thì khả năng sinh ethanol giảm mạnh. Tương tự như vây, dòng L2b2 và L07–1 có khả năng lên men tương đối
Hình 8 . Ảnh hƣởng của nhiệt độ ủ lên khả năng lên men của các dòng nấm men
45°C thì khả năng sinh ethanol giảm đáng kể. Khả năng lên men của các dòng nấm men bị giảm mạnh khi nhiệt độ ủ tăng lên là do nhiêt độ quá cao đã ức chế khả năng hoạt động cũng như phát triển của nấm men. Tuy nhiên trong thí nghiệm này dòng L2b2 thể hiện khả năng lên men khá ổn định khi nhiệt độ môi trường tăng cao (40°C). Cụ thể, khi nhiệt độ ủ tăng từ tự nhiên (28 – 32°C) lên đến 40°C khả năng sinh ethanol của dòng L2b2 vẫn tương đương với nhau và không có khác biệt về mặt thống kê trong khi các dòng còn lại bị hạn chế sự phát triển khi nhiệt độ ủ tăng dần. Cụ thể như dòng L29–1 khi ủ ở mức nhiệt độ tự nhiên và 35°C thì khả năng lên men tương đương với nhau và khác biệt không có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên khi tăng nhiệt độ ủ lên 40°C thì khả năng lên men của dòng nấm men này bị ức chế và giảm đáng kể (từ 2,93% w/v giảm xuống 1,99% w/v). Khi tăng nhiệt độ ủ lên 45°C thì khả năng lên men của L29–1 cũng như là 3 dòng nấm men còn lại dường như bị ức chế hoàn toàn. Vì vậy, trong thí nghiệm này ta dòng L2b2 thể hiện có tiềm năng hơn hẳn so với các dòng nấm men còn lại.
Vì thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát khả năng lên men ở nhiệt độ cao của các dòng nấm men nên nhiệt độ ủ cho các thí nghiệm tiếp theo được chọn là 40o
C. Dòng L2b2 có khả năng chịu nhiệt và chịu ethanol tương đối cao (45°C và 15%), có khả năng lên men đường glucose tương đối nhanh và ổn định (chiều cao cột khí CO2