Cấy chuyển các dòng vi khuẩn nội sinh trên môi trường NFb đặc có bổ sung tryptophan (100 μl/ 100 ml) và ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1 – 2 ngày, dòng nào phát triển thì có khả năng tổng hợp IAA. Chọn những dòng phát triển trên môi trường này đồng thời phát triển trên môi trường Burk không đạm và NBRIP đặc để tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp IAA trên môi trường NFb lỏng có bổ sung tryptophan sau 2, 4, 6 và 8 ngày. Mẫu được ủ trong tối.
Nguyên tắc: IAA phản ứng với thuốc thử Salkowski cho màu hồng nhạt đến đỏ tùy
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Chuẩn bị thuốc thử: đong 447 ml nước khử khoáng cho vào cốc có thể tích lớn
hơn 1 lít, đặt cốc này trong thau nước lạnh, cho từ từ 553 ml H2SO4 đậm đặc vào cốc trên, để nguội; cân 4,5 g FeCl3 trong cốc khác cũng có thể tích lớn hơn 1 l; rót từ từ dung dịch H2SO4 đã được pha loãng vào cốc chứa 4,5 g FeCl3, khuấy đều, để nguội; bảo quản trong chai tối màu.
Xây dựng đường chuẩn: Bảng 7: Đường chuẩn IAA
0 1 2 3 4 5 Nước khử khoáng (μl) 500 500 500 500 500 500 IAA chuẩn 10 mg/l (μl) 0 20 40 60 80 100 Thuốc thử (μl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Tổng thể tích (μl) 1500 1520 1540 1560 1580 1600 [IAA] (mg/l) 0 0,13 0,26 0,38 0,51 0,63
Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào 0,5 ml mẫu đã ly tâm và 1 ml thuốc thử rồi được khuấy đều bằng máy vortex, ổn định 15 – 20 phút ở nhiệt độ phòng rồi đo lượng IAA tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 530 nm. Các bước trên đều phải được thực hiện trong tối.