3.3.1. Thu thập và xử lý mẫu
- Mẫu lúa đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh được thu tại 5 địa điểm khác nhau tại huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên, mỗi địa điểm chọn 4 – 5 mẫu tại vị trí khác nhau trên cánh đồng.
- Rửa mẫu dưới vòi nước chảy mạnh cho sạch đất, loại bỏ những là già; cắt rời rễ, thân, lá và hạt thành từng đoạn nhỏ, để riêng trong túi nylon sạch, bảo quản ở 4oC nếu chưa phân lập.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Cho mẫu vào bình tam giác 100 ml và tiến hành khử trùng bề mặt lần lượt bằng các hóa chất sau: cồn 96%, và hydrogen peroxide (H2O2) 3%; sau mỗi lần khử trùng, rửa lại bằng nước cất vô trùng.
- Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa hóa chất còn thừa. Để kiểm tra vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, lấy 200 μl nước cất tiệt trùng rửa lần thứ 4 chủng trên môi trường Trypton – Yeast extract – Glucose agar, nếu sau 24 giờ, trên các đĩa môi trường này không xuất hiện khuẩn lạc thì các mẫu trên đã đạt yêu cầu.
- Cho khoảng 2 g mẫu rễ (hoặc thân, lá, cuống lá, hạt) cho vào cối vô trùng giã nhuyễn, thêm 0,5 – 1 ml nước cất cô trùng vào cối, trộn và hút phần dịch trích cho vào tuyp 1,5 ml.
3.3.2. Phân lập
- Môi trường NFb bán đặc được chuẩn bị như Bảng 2, khử trùng nhiệt ướt và phân phối 3 ml môi trường cho vào ống nghiệm đặt trên giá ống nghiệm và để nguội.
- Hút 500 μl dịch trích mẫu lần lượt cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường NFb bán đặc, lặp lại 3 lần, sau đó đậy nắp ống nghiệm lại và đem ủ ở 30oC khoảng 2 – 4 ngày.
- Sau 2 – 4 ngày, quan sát ống nghiệm, thấy có một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường, đó là dấu hiệu chứng tỏ sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.
- Cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường NFb đặc và ủ ở 30oC; sau 1-2 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, đều nhau nằm trên dường cấy, cấy chuyển sang những đĩa môi trường khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu ròng vào ống nghiệm chứa môi trường NFb đặc trữ ở -5oC và được xem là một dòng vi khuẩn.
3.3.3. Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
3.3.4. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn:
- Nhỏ 15 μl nước cất vô trùng lên kính mang vật (lame)
- Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật
- Đậy kính đậy vật (lammelle) lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu không có bọt khí.
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ở độ phóng đại 400 lần.
3.3.5. Nhuộm Gram vi khuẩn
Hình 4. Cấu trúc màng tế bào của vi khuẩn Gram âm và Gram dương
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Nguyên tắc:
Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể iot. Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài.
Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể iot, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể iot bên trong tế bào, nên tế bào vi khuẩn Gram dương có màu tím xanh của Crystal violet.
Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipid và làm tan màng ngoài của thành tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iot và tế bào Gram âm bị khử màu. Vậy, tế bào Gram âm có màu hồng của Fushin.
Quy trình:
- Lấy 10 μl nước cất vô trùng nhỏ lên kính mang vật
- Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi sinh vật trải đều lên kính - Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đền cồn, cố định vi sinh vật
- Nhỏ 1-2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều khoảng 2 phút
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô
- Rửa mẫu lại bằng cồn 70% đến khi mất hết nàu tím - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô vài giây - Nhỏ 1-2 giọt Fushin, trải đều, để yên 1 phút
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng đến khi khi mất hết màu Fushin - Dùng giấy thấm chấm nhẹ khô nước
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.3.5. Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ bằng phương pháp Indolephenol Blue (Page
et al., 1982)
Do có khả năng tổng hợp đạm từ không khí, các vi khuẩn có khả năng cố định đạm có thể phát triển trên môi trường không đạm. Cấy chuyển các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Burk không đạm đặc, ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển trong 1 – 2 ngày. Những dòng phát triển được là những dòng có khả năng cố định đạm. Những dòng vi khuẩn này được nuôi tăng sinh trong môi trường NFb lỏng trong 1 – 2 ngày trước khi chủng vào môi trường Burk không đạm lỏng để tiến hành khảo sát khả năng cố định đạm sau 2, 4, 6 và 8 ngày.
Nguyên tắc: Nồng độ NH4+ được xác định nhờ phản ứng giữa NH3 tác dụng với
hypochloride (ở pH 8-11,5) hình thành hợp chất trung gian monochloramine. Chất này sẽ kết hợp với phenol và hypochloride dư với sự xúc tác của nitroprusside tạo thành hợp chất Indolephenol có màu xanh.
Hóa chất cần chuẩn bị:
- Dung dịch mẹ EDTA: cân 6 g EDTA cho vào 80 ml nước khử khoáng, thêm nước cho đủ 100 ml, chỉnh pH về 7.
- Dung dịch mẹ phenol – nitroprusside: cân 7 g phenol (C2H5OH) và 0,034 g nitroprusside (Na2Fe(CN)5NO(2H2O)), thêm nước khử khoáng cho đến 100 ml. Chú ý: phenol có thể gây phỏng, cần trang bị bao tay, khẩu trang và cẩn thận khi thao tác với phenol.
- Dung dịch mẹ Sodium hypochloride: cân 1,48 g NaOH và 4,98 g Na2HPO4, chuẩn bị sẵn 80 ml nước và 20 ml dung dịch NaOCl, khi thêm NaOCl xong thì thêm nước ngay sau đó cho đủ 100 ml.
Xây dựng đường chuẩn NH4+: Chuẩn bị 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự từ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bảng 5: Đường chuẩn NH4+
0 1 2 3 4 5
NH4+ 1 mg/l (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Nước khử khoáng (ml) 2,5 2 1,5 1 0,5 0
Dung dịch EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Dung dịch phenol – nitroprusside (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch sodium hypochloride (ml) 2 2 2 2 2 2
Tổng thể tích (ml) 6 6 6 6 6 6
[NH4+] (mg/l) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào: 2 ml nước khử khoáng, 0,5 ml mẫu đã ly tâm, 0,5 ml dung dịch EDTA, 1 ml dung dịch phenol – nitroprusside, 2 ml dung dịch sodium hypochloride; trộn đều bằng máy vortex, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 15 – 20 phút và tiến hành đo lượng đạm tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 636 nm.
3.3.6. Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan (Barrows et al., 1985)
Tương tự khảo sát năng cố định đạm, sau khi được cấy chuyển trên môi trường NBRIP đặc trong 1 – 2 ngày ở 30oC, các dòng vi khuẩn nội sinh phát triển tốt trên cả môi trường này và môi trường Burk không đạm được nhân sinh khối trong môi trường NFb lỏng rồi chủng vào môi trường NBRIP lỏng. Khả năng hòa tan lân khó tan được định lượng sau 5, 10, 15 và 20 ngày.
Nguyên tắc: Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate của các chủng vi sinh vật dựa
trên nồng độ P2O5 có trong dịch nuôi cấy. Nồng độ P2O5 càng cao chứng tỏ lượng phosphate khó tan bị phân giải càng nhiều. Nồng độ P2O5 được xác định bằng phương pháp xanh molybdate. Nguyên tắc của phương pháp là ion P2O5 sẽ phản ứng với ammonium molybdate tạo ra phức chất PMo12O403− màu vàng. Phức chất này bị ascorbic acid khử thành phức màu xanh PMo12O407− . Màu xanh càng đậm thì chứng tỏ lượng P2O5
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Chuẩn bị hóa chất:
- Dung dịch A: chuẩn bị sẵn 1 lít nước khử khoáng được đặt trong thau nước lạnh, cho từ từ 140 ml H2SO4 đậm đặc vào, để nguội; cân 12 g ammonium molybdate ((NH4)6Mo7O24) cho vào 100 ml nước khử khoáng; cân 0,2908 g potassium antymonyl tartrate (KSbOC4H4O6) cho vào 100 ml nước khử khoáng; trộn ba dung dịch trên lại rồi thêm nước cho đủ 2 l. Chú ý: cẩn thận khi thao tác với H2SO4 đậm đặc.
- Dung dịch B: cân 1,056 g acid ascorbic vào 200 ml dung dịch A.
Xây dựng đường chuẩn P2O5: chuẩn bị 6 ống nghiệm như sau:
Bảng 6: Đường chuẩn P2O5 0 1 2 3 4 5 Nước khử khoáng (ml) 4 4 4 4 4 4 P2O5 10 mg/l (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4 Nước khử khoáng (ml) 4,5 4 3,5 3 2,5 2 Tổng thể tích (ml) 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 [P2O5] (mg/l) 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào: 4 ml nước khử khoáng, 0,5 ml mẫu đã ly tâm, 4 ml dung dịch B, 4 ml nước khử khoáng; trộn đều bằng máy vortex, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 15 – 20 phút và tiến hành đo lượng lân được hòa tan bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 880 nm.
3.3.7. Định lượng IAA bằng phương pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995)
Cấy chuyển các dòng vi khuẩn nội sinh trên môi trường NFb đặc có bổ sung tryptophan (100 μl/ 100 ml) và ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1 – 2 ngày, dòng nào phát triển thì có khả năng tổng hợp IAA. Chọn những dòng phát triển trên môi trường này đồng thời phát triển trên môi trường Burk không đạm và NBRIP đặc để tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp IAA trên môi trường NFb lỏng có bổ sung tryptophan sau 2, 4, 6 và 8 ngày. Mẫu được ủ trong tối.
Nguyên tắc: IAA phản ứng với thuốc thử Salkowski cho màu hồng nhạt đến đỏ tùy
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Chuẩn bị thuốc thử: đong 447 ml nước khử khoáng cho vào cốc có thể tích lớn
hơn 1 lít, đặt cốc này trong thau nước lạnh, cho từ từ 553 ml H2SO4 đậm đặc vào cốc trên, để nguội; cân 4,5 g FeCl3 trong cốc khác cũng có thể tích lớn hơn 1 l; rót từ từ dung dịch H2SO4 đã được pha loãng vào cốc chứa 4,5 g FeCl3, khuấy đều, để nguội; bảo quản trong chai tối màu.
Xây dựng đường chuẩn: Bảng 7: Đường chuẩn IAA
0 1 2 3 4 5 Nước khử khoáng (μl) 500 500 500 500 500 500 IAA chuẩn 10 mg/l (μl) 0 20 40 60 80 100 Thuốc thử (μl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Tổng thể tích (μl) 1500 1520 1540 1560 1580 1600 [IAA] (mg/l) 0 0,13 0,26 0,38 0,51 0,63
Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào 0,5 ml mẫu đã ly tâm và 1 ml thuốc thử rồi được khuấy đều bằng máy vortex, ổn định 15 – 20 phút ở nhiệt độ phòng rồi đo lượng IAA tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 530 nm. Các bước trên đều phải được thực hiện trong tối.
3.3.8. Xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm được xử lý và phân tích bằng phần mềm Microsorf Excel 2003 và các trị số trung bình của các nghiệm thức được đánh giá sự khác biệt bằng LSD.01.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn 4.1.1. Phân lập vi khuẩn 4.1.1. Phân lập vi khuẩn
Bảng 8: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường NFb
STT Dòng vi khuẩn Giống lúa Vị trí phân lập Địa điểm thu mẫu
1 PH1 ML 213 Rễ Phú Hòa 2 PH2 ML 216 Rễ Phú Hòa 3 PH3 ML 213 Rễ Phú Hòa 4 PH4 ML 213 Rễ Phú Hòa 5 PH5 ML 213 Rễ Phú Hòa 6 PH6 ML 216 Rễ Phú Hòa 7 PH7 ML 213 Rễ Phú Hòa 8 PH8 ML 4-2 Rễ Phú Hòa 9 PH9 ML 4-2 Rễ Phú Hòa 10 PH10 ML 213 Rễ Phú Hòa 11 PH11 ML 216 Rễ Phú Hòa 12 PH12 ML 216 Thân Phú Hòa 13 PH13 ML 213 Thân Phú Hòa 14 PH14 ML 213 Thân Phú Hòa 15 PH15 ML 4-2 Thân Phú Hòa 16 PH16 ML 4-2 Thân Phú Hòa 17 PH17 ML 213 Thân Phú Hòa 18 PH18 ML 213 Thân Phú Hòa 19 PH19 ML 216 Thân Phú Hòa 20 PH20 ML 216 Thân Phú Hòa 21 PH21 ML 213 Thân Phú Hòa 22 PH22 ML 213 Thân Phú Hòa 23 PH23 ML 216 Thân Phú Hòa 24 PH24 ML 4-2 Thân Phú Hòa 25 PH25 ML 4-2 Thân Phú Hòa
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Qua các giai đoạn phân lập và tách ròng, hai mươi lăm dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ và thân của các mẫu lúa thu thập từ một số cánh đồng trên đại bàn huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên trên môi trường NFb. Nguồn gốc và ký hiệu của các dòng vi khuẩn phân lập được trình bày trong Bảng 8.
Hình 5. Vòng pellicle xuất hiện sau 2-3 ngày chủng
Các dòng vi khuẩn phân lập được đều có chung đặc tính sinh trưởng va phát triển ở điều kiện vi hiếu khí trong môi trường NFb bán đặc. Khi tăng trưởng, vi khuẩn phát triển hình thành vòng sáng màu trắng (vòng pellicle) cách bề mặt môi trường 2-5 mm sau 2-3 ngày nuôi và đồng thời làm đổi màu môi trường NFb từ xanh lá cây (pH 6,8) sang màu xanh dương do trong môi trường có chứa chất chỉ thị màu Bromothymol Blue.
4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc và đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn phân lập
Hai mười lăm dòng vi khuẩn phân lập với khuẩn lạc có nhiều đặc điểm khác nhau được mô tả dựa vào hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa và kích thước khuẩn lạc (Bảng 9).
Hai mươi ba dòng vi khuẩn (chiếm tỉ lệ 92%) có khuẩn lạc dạng hình tròn, mô, bìa nguyên và hai dòng còn lại cho khuẩn lạc dạng không đều, lài và bìa răng cưa.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Màu sắc: Phần lớn các khhuẩn lạc do các dòng vi khuẩn tạo ra có màu trắng đục, một số có màu trắng trong, một số ít có màu vàng nhạt và vàng trong. Trong tổng số dòng vi khuẩn phân lập được, có mười lăm dòng tạo khuẩn lạc màu trắng đục (tỉ lệ 60%), bảy dòng có khuẩn lạc màu trắng trong (tỉ lệ 28%), hai dòng tạo khuẩn lạc màu vàng nhạt (tỉ lệ 8%) và một dòng có khuẩn lạc màu vàng trong (tỉ lệ 4%).
Kích thước: đường kính khuẩn lạc của hai mươi lăm dòng vi khuẩn dã phân lập dao