et al., 1982)
Do có khả năng tổng hợp đạm từ không khí, các vi khuẩn có khả năng cố định đạm có thể phát triển trên môi trường không đạm. Cấy chuyển các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Burk không đạm đặc, ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển trong 1 – 2 ngày. Những dòng phát triển được là những dòng có khả năng cố định đạm. Những dòng vi khuẩn này được nuôi tăng sinh trong môi trường NFb lỏng trong 1 – 2 ngày trước khi chủng vào môi trường Burk không đạm lỏng để tiến hành khảo sát khả năng cố định đạm sau 2, 4, 6 và 8 ngày.
Nguyên tắc: Nồng độ NH4+ được xác định nhờ phản ứng giữa NH3 tác dụng với
hypochloride (ở pH 8-11,5) hình thành hợp chất trung gian monochloramine. Chất này sẽ kết hợp với phenol và hypochloride dư với sự xúc tác của nitroprusside tạo thành hợp chất Indolephenol có màu xanh.
Hóa chất cần chuẩn bị:
- Dung dịch mẹ EDTA: cân 6 g EDTA cho vào 80 ml nước khử khoáng, thêm nước cho đủ 100 ml, chỉnh pH về 7.
- Dung dịch mẹ phenol – nitroprusside: cân 7 g phenol (C2H5OH) và 0,034 g nitroprusside (Na2Fe(CN)5NO(2H2O)), thêm nước khử khoáng cho đến 100 ml. Chú ý: phenol có thể gây phỏng, cần trang bị bao tay, khẩu trang và cẩn thận khi thao tác với phenol.
- Dung dịch mẹ Sodium hypochloride: cân 1,48 g NaOH và 4,98 g Na2HPO4, chuẩn bị sẵn 80 ml nước và 20 ml dung dịch NaOCl, khi thêm NaOCl xong thì thêm nước ngay sau đó cho đủ 100 ml.
Xây dựng đường chuẩn NH4+: Chuẩn bị 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự từ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bảng 5: Đường chuẩn NH4+
0 1 2 3 4 5
NH4+ 1 mg/l (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Nước khử khoáng (ml) 2,5 2 1,5 1 0,5 0
Dung dịch EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Dung dịch phenol – nitroprusside (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch sodium hypochloride (ml) 2 2 2 2 2 2
Tổng thể tích (ml) 6 6 6 6 6 6
[NH4+] (mg/l) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào: 2 ml nước khử khoáng, 0,5 ml mẫu đã ly tâm, 0,5 ml dung dịch EDTA, 1 ml dung dịch phenol – nitroprusside, 2 ml dung dịch sodium hypochloride; trộn đều bằng máy vortex, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 15 – 20 phút và tiến hành đo lượng đạm tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 636 nm.