Phƣơng pháp lai tạo
+ Bƣớc 1: Chuẩn bị cây cha mẹ: những cây cha mẹ đƣợc trồng trong chậu và trồng ba lần, mỗi lần cách nhau 7 ngày đủ đảm bảo trổ hoa cùng lúc.
+ Bƣớc 2: Khử nhị đực là tiến hành lấy nhị đực ra khỏi cây lúa, những cây đƣợc khử đực đƣợc dùng làm cây mẹ.
Kỷ thuật đơn giản nhất và hiệu quả nhất là cắt vỏ trấu và rút nhị đực bằng kẹp nhỏ.
Chọn bông phải trổ khỏi bẹ khoảng 50-60%, cẩn thận tách bông đƣợc chọn ra khỏi những bông xung quanh để dễ làm, tách bông đƣợc chọn ra khỏi bẹ lá đừng làm gãy lá cờ.
Dùng kéo cắt bỏ tất cả hoa đã nở từ chóp bông (nhị đực đã phơi ra) và hoa còn non ở cuối bông, là những hoa mà mà nhị đực bên trong chƣa nhô lên tới nữa bề cao của vỏ trấu.
Dùng kéo cắt xiên vỏ trấu, bỏ đi từ 1/3 vỏ trấu để lộ ra những túi phấn. Không nên cắt quá thấp để làm tổn thƣơng nƣớm nhụy cái, nếu cắt quá cao sẽ khó khử nhị đực và khó rơi xuống nƣớm nhụy cái.
Loại bỏ nhị đực: gấp lần lƣợt từng bao phấn ra ngoài (6 bao phấn) phải thật cẩn thận để không thiệt hại tới nƣớm nhụy.
Ghi ký hiệu trên bao: dùng bao bằng giấy bóng mờ, chi tiết cần ghi: ngày khử đực, tên ngƣời lai, tên tổ hợp lai.
Bao bông lúa: khi cả bông lúa đả đƣợc khử đực, bao cả bông lúa bằng giấy bóng mờ, xếp túm phần miệng bao lại và kẹp chỗ đó vào gần cổ bông để giữ bông cho chặt.
+ Bƣớc 3: Kiểm tra lại những bông đã đƣợc khử đực xem còn sót lại túi phấn nào không.
Lấy những bông cho phấn: dự kiến đủ thời gian lấy những bông cho phấn trƣớc khi hoa nở (tùy thuộc vào thời tiết).
Lấy phấn của cây cha và lần lƣợt gấp cho vào các bông đã khử đực, sau đó bao giấy bóng mờ lại.
Bảo vệ các chậu lúa tránh mƣa gió nhƣng phải nhận đƣợc ánh sáng đầy đủ. Ngừa chuột, chim và những dịch hại khác.
Độ trở hồ
Tiến hành theo phƣơng pháp của IRRI ,(1979).
Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng đƣợc thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt để vào đĩa petri.
Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi đĩa.
Đậy đĩa petri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.
Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1986) đƣợc trình bày ở bảng
Bảng 2.2 Phân cấp độ trở hồ theo IRRI (1979)
Cấp Độ lan rộng Độ trở hồ
1 Hạt gạo còn nguyên. Cao
2 Hạt gạo phồng lên. Cao
3 Hạt gạo phồng lên; viền còn nguyên hay rõ nét. Cao
4 Hạt gạo phồng lên; viền còn nguyên và nở rộng. Trung bình 5 Hạt rã ra; viền hoàn toàn nở rộng. Trung bình
6 Hạt tan ra hòa chung với viền. Thấp
7 Hạt tan hoàn toàn và quyện vào nhau. Thấp
Độ bền thể gel
Dựa theo phƣơng pháp của Tang và ctv.,(1991). + Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu
Tách vỏ trấu và đo độ ẩm hạt gạo.
Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue. Thêm 2 ml KOH 0,2 N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex. Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 1000
C) khoảng 5 phút. Lấy ra để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong nồi nƣớc đá 10 phút . + Bƣớc 3: Đọc và ghi kết quả
Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của gel).
Bảng 2.3 Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI, (1996)
Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel
1 80-100 Rất mềm 3 61-80 Mềm 5 41-60 Trung bình 7 35-40 Cứng 9 < 35 Rất cứng Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein
Tiến hành theo phƣơng pháp Lowry O.H. (1951). Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch ly trích
+ Dung dịch NaOH 0,1N.
+ Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,05% + NaOH 0,1N). + Dung dịch B (CuSO4 0,1%).
+ Dung dịch C (A:B = 45:5). + Dung dịch Folin 1N
Bƣớc 2: Chuẩn bị mẫu
+ Cân 10mg bột gạo +1ml NaOH 0,1N. + Lắc ít nhất 2 giờ hay để qua đêm. Bƣớc 3: Pha loãng mẫu và đo
+ Ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
+ Hút 100µl mẫu + 1000µl nƣớc cất + 5ml dung dịch C. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 100µl NaOH 0,1N.
+ Trộn đều và để yên trong 10 phút.
+ Lắc đều mẫu, sau đó cho vào cuvette và đo ở bƣớc sóng 580nm. Bƣớc 4: Dựng đƣờng chuẩn và tính kết quả
+ Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). + Đƣờng chuẩn có dạng:
Y = aX + b
+ Trong đó Y: Độ hấp thụ
X: Lƣợng protein có trong mẫu đem đo.
+ Hàm lƣợng protein đƣợc tính theo công thức: %Protein = (X/100)x100
- Dựa theo phƣơng pháp của Lowry O.H. và ctv. (1951)
+ Hàm lƣợng Protein là yếu tố thể hiện chất dinh dƣỡng của hạt gạo. Gạo có hàm lƣợng Protein càng cao càng có giá trị dinh dƣỡng cao và ngày càng đƣợc lƣu tâm trong giới tiêu dùng (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Prôtêin trong hạt gạo có giá trị cao hơn các loại ngũ cốc khác vì hàm lƣơng Lysin khá cao 3,5-4% (Bùi Chí Bữu và Nguyễn Thị Lang, 2000). Các thành phần Protein của trong hạt đƣợc phân ra làm bốn loại: albumin, globulin, prolamin, glutelin.
+ Hàm lƣợng Protein đƣợc tính theo công thức: Phần trăm Protein (%P) = (X/m) x 100 Với: m là trọng lƣơng thực của mẫu m = (10 x (100 – H%))/ (100-14) H%: Độ ẩm của mẫu
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng Amylose
Tiến hành theo phƣơng pháp Cagampang and Rodriguez (1980). Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch
+ Ethanol 95%. + HCL 30%. + NaOH 1N.
+ Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI). Bƣớc 2: Chuẩn bị mẫu
+ Thêm 0,5ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều. + Để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
Bƣớc 3: Pha loãng và đo mẫu
+ Rút 100µl dịch trích cho vào bình định mức 25ml (đối với mẫu thử thay dịch trích bằng 100µl NaOH 1N).
+Thêm nƣớc cất khoảng ½ bình, lắc đều. + Thêm nƣớc cất đến vạch định mức.
+ Chuyển sang ống 50ml, lắc đều và để yên trong 30 phút.
+ Lắc đều trƣớc khi cho vào cuvette. Đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 580nm. Bƣớc 4: Dựng đƣờng chuẩn và tính kết quả
+ Đƣờng chuẩn có dạng: Y = aX +b
Trong đó Y: Độ hấp thụ OD
X: Lƣợng Amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml). + Tính hàm lƣợng Amylose theo công thức:
%Amylose=(X/TL mẫu)x100
Amylose là thành phần tinh bột không phân nhánh trong gạo. Hàm lƣợng amylose có ảnh hƣởng chủ yếu đến đặc tính của cơm. Nó tƣơng quan nghịch với độ dẻo, độ mềm, màu và độ bóng của cơm. Trong gạo hàm lƣợng amylose biến thiên từ 15-35%. Gạo có hàm lƣợng amylose cao (>25%), cơm sẽ nở nhiều và dễ tróc, nhƣng cơm khô và cứng khi nguội, ngƣợc lại, gạo có hàm lƣợng amylose thấp thì nấu ít nở, cơm mềm và dẻo (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
Bảng 2.4 Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lƣợng amylose cho lúa (IRRI, 1988)
STT Phân nhóm Amylose (%) Cấp độ
1 Nếp 1-2 Rất thấp
2 Lúa dẻo cơm 8-20 Thấp
3 Lúa mềm cơm 21-25 Trung bình
Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu mặn
Theo phƣơng pháp của IRRI, 1997 có bổ sung dung dịch dinh dƣỡng Yoshida.
Độ mặn 12‰, 14‰, 16‰.
Giống: các giống lúa nêu ở phần vật liệu thí nghiệm, giống Đốc Phụng đƣợc làm giống đối chứng chuẩn kháng; giống IR28 đƣợc làm giống đối chứng chuẩn nhiễm ( Nguyễn Thanh Tƣờng và ctv., 2005).
Vật liệu chính gồm: + Khay nhựa Hình chữ nhật kích thƣớc 14 x 30 x 35 + Lƣới chống muỗi + Tấm xốp dày khoảng 1,2-2,5 cm + Muối NaCl + Dung dịch Yoshida + Máy đo nồng độ muối + Cây gấp hạt lúa
Bảng 2.5 Têu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trƣởng và phát triển (IRRI, 1997)
Cấp Mô tả triệu chứng Đánh giá
1 Tăng trƣởng binh thƣờng không có vết lá
cháy Chống chịu tốt
3 Gần nhƣ bình thƣờng, nhƣng đầu lá hoặc
vài lá có vết trắng, lá hơi cuốn lại Chống chịu 5 Tăng trƣởng chậm, hết lá bị khô, một vài
chồi bị chết Chống chịu trung bình
7 Tăng trƣởng bị ngƣng lại hoàn toàn, hầu
hết lá khô, một vài cây bị chết Nhiễm
9 Tất cả cây chết hoặc khô Rất nhiễm
Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng rầy
Phƣơng pháp thử rầy (theo bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ).
Cách tiến hành
+ Nuôi rầy
Rầy nâu đƣợc nuôi trên khay lúa 30 ngày tuổi. Giống lúa đƣợc dùng để nuôi rầy là Jasmine 85. Khay dùng để nuôi rầy có chiều dài 30 cm, rộng 15 cm. Mỗi khay trồng 5-7 bụi lúa. Những khay này đƣợc đặt trong tủ kín có lƣới bao xung
quanh bên trong khay nhựa có chứa đất và một lớp nƣớc khoảng 2-3 cm nhằm tạo ẩm độ cho rầy phát triển. Mỗi ngăn của tủ có khoảng 3-5 khay. Trƣớc khi thả rầy vào, làm sạch gốc lúa, tỉa bỏ những bẹ lá già, bẹ gần sát mặt nƣớc, đảm bảo những bẹ mang trứng không rơi xuống nƣớc. Sau khi chuẩn bị khay nuôi rầy, tiến hành bắt rầy cái có bụng to thả vào. Số lƣợng rầy cái thả vào tùy thuộc vào số lƣợng giống làm trắc nghiệm và mật độ thả vào. Thông thƣờng một rầy cái cánh ngắn có thể đẻ 300-400 trứng, rầy cái cánh dài có thể đẻ 100 trứng.
+ Chuẩn bị lúa trắc nghiệm
Hai ngày sau khi thả rầy, tiến hành gieo giống lúa trắc nghiệm (đã đƣợc ngâm 24 giờ, ủ 48 giờ trƣớc đó) vào rỗ nhựa 30 x 25 cm, có chứa sẵn một lớp đất dày 5 cm. Gieo ngẫu nhiên mỗi giống một hàng. Mỗi rỗ là một lần lặp lại. Sau khi gieo đặt rỗ nhựa vào khay nhựa 45 x 60 cm bên trong có sẵn một lớp nƣớc mỏng 2- 3 cm để ngăn ngừa kiến và tạo ẩm độ cho lúa phát triển. Một tuần sau khi gieo tỉa bỏ mỗi hàng chừa 15 cây.
+ Thả rầy
Khi lúa ở nghiệm thức đƣợc 2-3 lá thật (5-7 ngày tuổi), tiến hành bắt rầy tuổi 1-2 thả vào, mật số 5-8 con/cây. Rầy đƣợc thả vào bằng cách cắt ngang cây lúa sau đó gõ nhẹ.
+ Thu thập chỉ tiêu
Chỉ tiêu đƣợc thu thập khi trên 100% giống lúa chuẩn nhiễm Jassmine 95 chết hoàn toàn. Khả năng kháng rầy đƣợc đánh giá theo tiêu chuẩn đánh giá quốc tế (Standard Evaluation System for Rice, 1980).
Bảng 2.6 Bảng đánh giá khả năng kháng rầy theo tiêu chuẩn quốc tế IRRI, (1980)
Cấp Đánh giá Biểu hiện
0 Rất kháng Không thiệt hại 1 Kháng Thiệt hại nhẹ
3 Hơi kháng Lá thứ nhất và thứ hai của hầu hết các cây bị vàng một phần 5 Hơi nhiễm Cây vàng phân nửa số cây héo và chết
7 Nhiễm Hơn phân nữa số cây chết, còn lại còi cọc nặng 9 Rất nhiễm Tất cả mọi cây đều chết
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Đặc tính phẩm chất của cây cha mẹ
Qua Bảng 3.1 ta thấy hàm lƣợng amylose của hai dòng lúa mẹ, cha đều thuộc phân nhóm thấp (<20%) và hàm lƣợng protein thuộc phân nhóm cao (>7%) vì vậy mục tiêu của phép lai là giữ lại những đặc tính tốt của cây mẹ, cha. Do khả năng chịu mặn của cây mẹ CTUS1 (10‰) kém hơn khả năng chịu mặn của cây cha THL1 (15‰) nên phép lai đƣợc thực hiện nhằm mục đích tạo ra các tổ hợp lai có khả năng chịu mặn lớn hơn 10‰. Phép lai cây mẹ CTUS1 và cây cha THL1 (cả hai chƣa thuần) là để rút ngắn thời gian trong công tác chọn giống cũng nhƣ tìm đƣợc những tổ hợp lai phù hợp với mục tiêu của đề tài đặt ra, bên cạnh đó thì khi lai hai dòng lúa và tổ hợp lai còn có sự phân li về mặt di truyền sẽ tạo cơ hội cho nhà công tác giống có thể tìm ra các tổ hợp lai mới có ý nghĩa.
Bảng 3.1 Khả năng chịu mặn, hàm lƣợng amylose và protein của cây cha, mẹ
STT Dòng Chịu mặn (‰) Hàm lƣợng Amylose (%) Hàm lƣợng protein ((%) 1 THL1 15 15,08 9,33 2 CTUS1 10 17,85 7,5
Trong quá trình lai tạo, do hoa lúa nhỏ nên thao tác khử đực lúa gặp khó khăn và dễ làm hoa lúa bị tổn thƣơng. Vì vậy, kết quả thu đƣợc 5 hạt lai từ tổ hợp lai CTUS1 X THL1 và đƣợc đặt tên là THL17. Các hạt F1 thu đƣợc trong giai đoạn đầu thƣờng có khả năng nảy mầm yếu.
3.2 Thế hệ F1
3.2.1 Kết quả chạy điện di protein tổng số các hạt thế hệ F1
Các hạt lai F1 thu đƣợc sau khi lai đƣợc tiến hành điện di protein tổng số với đối chứng cây cha, mẹ, để kiểm tra khả năng tự thụ, đồng thời đánh giá sơ bộ về hàm lƣợng amylose và protein của các hạt lai dựa vào kết quả điện di protein tổng số của hạt F1 so với hạt cha và mẹ của THL17.
Giếng (*) là giếng đƣợc chọn gồm giếng 3, 6, 7, 8 Giếng 1: THL1, Giếng 2: CTUS1
Từ giếng 3 đến giếng 10 là dòng THL17
Hình 3.1 Phổ điện di protein tổng số các cá thể của dòng THL17
Qua kết quả điện di cho thấy các loại protein bị phân tách ra dựa theo trọng lƣợng phân tử, trong đó protein nào có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn thì di chuyển trong gel acrylamide nhanh hơn, bao gồm các loại protein tƣơng ứng với trọng lƣợng giảm dần: Proglutelin, α-Glutelin và Globulin, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Tanaka và Yamagata, (1986). Các cá thể có sự khác biệt rõ ràng giữa các band dựa vào sự ăn màu đậm nhạt khác nhau đối với thuốc nhuộm Commassie Brilliant Blue R250 bao gồm Waxy, Proglutelin và Globulin. Trong đó nhận thấy rõ nhất là band α-Glutelin, Globulin và Proglutelin. Các giếng của hạt F1 có sự khác biệt, nhất là ở band Waxy 60 KDa do cha, mẹ chƣa thuần. Các giếng 3, 6, 7, 8 ăn màu nhạt hơn so với các giếng còn lại. Từ đây ta chọn những cá thể có hàm lƣợng amylose thấp thông qua sự biểu hiện của band Waxy nhạt vì theo Võ Công Thành (2003) thì sự biểu hiện của band Waxy trên gel điện di có sự tƣơng quan chặt với hàm lƣợng amylose. Các cá thể phù hợp là ở các giếng 3, 6, 7, 8. Kết quả phổ diện di cho thấy, tất cả các dòng tổ hợp lai có band α-Glutelin ăn màu đậm với thuốc nhuộm. Theo Cagampang và ctv. (1966) thì Glutelin chiếm khoảng 80%
protein tổng số vì thế dựa vào band α-Glutelin có thể đánh giá hàm lƣợng protein trong hạt. Waxy 60 KDa Proglutelin 57 KDa α-Glutelin 37-39 KDa Globulin 26 KDa β-Glutelin 22-23 KDa 1 2 3* 4 5 6* 7* 8* 9 10
3.2.2 Chỉ tiêu nông học của cây F1
Qua kết quả điện di ta thấy thế hệ F1 đã thể hiện những đặc tính tốt trung gian giữa cây cha, mẹ. Tiến hành trồng và theo dõi các chỉ tiêu nông học.
Bảng 3.2 Một số chỉ tiêu nông hoc của cây F1 so với cây cha, mẹ
STT Chỉ tiêu THL1 CTUS1 Cây F1
1 TGST (ngày) 95 110 93
2 Chiều cao cây (cm) 85 120 91
3 Chiều dài bông (cm) 25 26,5 26
4 Bông/bụi 16 9 12
5 Tỉ lệ chắc/bông (%) 93,45 82,18 80,67
6 Chắc/bông 89 106 109
7 Màu sắc Trắng Đỏ Đỏ
TGST: Thời gian sinh trưởng
Thời gian sinh trƣởng của cây F1 trung bình là 93 ngày (Bảng 3.2) khá ngắn, ngắn hơn so với thời gian sinh trƣởng của cây cha, mẹ. Theo Yoshida (1972), các giống lúa có thời gian sinh trƣởng khoảng 90 ngày, nếu cấy khoảng 100 ngày là thời gian ngắn nhất, hợp lý nhất để đạt năng suất cao. Theo Bùi Chí Bửu (1998), thì đây là thời gian lý tƣởng trong tình hình sản xuất lúa cao sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Chiều cao cây đƣợc tính từ gốc đến đỉnh bông lúa cao nhất của bụi. Kết quả của Bảng 3.2 cho thấy chiều cao của cây F1 trung bình là 91 cm, thấp hơn cây mẹ CTUS1 (120 cm) và cao hơn cây cha THL1 (85 cm). Do đó, thế hệ F1 thể hiện đặc tính trung gian của cha, mẹ.
Chiều dài bông trung bình của cây F1 là 26 cm gần bằng với chiều dài bông của cây cha THL1 (26,5 cm) và dài hơn chiều dài trung bình của cây mẹ CTUS1