3. Bacillus thuringiensis và thuốc trừ sõu sinh học Bt
2.1.3.1. Cỏc mụi trường nuụi cấy sử dụng
a. Mụi trường MPA:
Thành phần 1000 ml Đơn vị Nước thịt và cao thịt 3 G Pepton 5 G NaCl 5 G Thạch 20 G Nước 1000 Ml
b. Mụi trường phõn lập E.Coli và Coliform: Thành phần 2000 ml Đơn vị Nước thịt và cao thịt 3 G Pepton 5 G NaCl 5 G Lactose 10 G Chỉ thị phenol đỏ 75 Ml Nước cất 2000 Ml 2.1.3.2. Thiết bị và dụng cụ thớ nghiệm: -Cõn phõn tớch
-Tủ cấy vi sinh (Class II Biohazard Cabinet- Esco) -Tủấm (Binder )
-Mỏy lắc (Shel lab)
-Nồi khử trựng (SA-300VF)
-Cỏc dụng cụ thủy tinh: bỡnh nún, ống nghiệm, đĩa petri…và cỏc dụng cụ phõn tớch khỏc.
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.1. Bảo quản giống: Chủng vi khuẩn Baciluss thuringiensis được bảo quản trong ống thạch nghiờng và giữ trong tủ lạnh ở 40C để phục vụ nghiờn cứu và bảo trong ống thạch nghiờng và giữ trong tủ lạnh ở 40C để phục vụ nghiờn cứu và bảo quản lõu dài trong glyxerin ở -200C, trong đụng khụ.
Khi cần dựng giống để thực hiện thớ nghiệm, ta cần tiến hành hoạt hoỏ giống
như sau: cấy chuyển giống từ ống thạch nghiờng sang dịch nuụi cấy MPB và tiến hành nuụi trong điều kiện lắc 200 vũng/phỳt, 30oC trong 12h.
2.2.2. Phương phỏp phõn tớch cỏc thụng số của bựn thải: pH, TS, VS, TN, TP, C, và cỏc kim loại cú trong bựn thải: Ca, Na, Al, Cd, Cr, Cu…. được phõn tớch TP, C, và cỏc kim loại cú trong bựn thải: Ca, Na, Al, Cd, Cr, Cu…. được phõn tớch theo Standard Method hoặc theo tiờu chuẩn phõn tớch hiện hành.
2.2.3. Phương phỏp phõn tớch cỏc chỉ tiờu vi sinh vật: Sử dụng phương phỏp xỏc định theo TCVN 5165 – 1990: xỏc định theo TCVN 5165 – 1990:
Sử dụng mụi trường MPB (thành phần mụi trường MPA cũng giống như mụi trường MPA nhưng ko cú thạch). Sau khi pha mụi trường được khử trựng ở 1210C trong vũng 30 phỳt. Sau đú, mụi trường nuụi cấy được đổ vào đĩa petri đó được khử
trựng và được giữ trong tủ ấm 300C trong vũng 48h để loại cỏc đĩa mụi trường bị
nhiễm vi sinh vật, cỏc đĩa khụng bị nhiễm được sử dụng để xỏc số lượng vi sinh vật tổng số.
• Pha loóng mẫu và xỏc định số lượng
Đối với bựn cõn10g mẫu cho vào 90ml dung dịch đệm, cũn đối với mẫu nước cho 1ml mẫu vào 9ml dung dịch được nồng độ pha loóng 10-1. Từ dịch huyền phự ở
nồng độ 10-1 hỳt 1ml cho vào 9ml dung dịch đệm được nồng độ pha loóng 10-2 và làm tương tựđối với cỏc nồng độ pha loóng tiếp theo cho đến nồng độ thớch hợp cho xỏc định số lượng vi sinh tổng số.
Sau khi đó pha loóng mẫu đến nồng độ cần thiết, tiến hành cấy lờn đĩa thạch ở
hai nồng độ liờn tiếp với sự lặp lại ở mỗi nồng độ là 3 đĩa với thể tớch là 0,1ml/đĩa, trang đều và để cỏc đĩa thạch đó cấy mẫu vào tủấm 300C. Sau 48h nuụi cấy trong tủ ấm lấy đĩa thạch ra đếm khuẩn lạc (Số khuẩn lạc trờn 1 đĩa dao động từ 15 – 300 khuẩn lạc là số liệu cú thể chất nhận).
Số lượng vi sinh vật tổng sốđược xỏc định bằng cụng thức sau: X = (C x 10)/(n1 + 0,1 x n2) x d
Trong đú: X: Số lượng vi sinh vật tổng số (CFU/g hoặc CFU/ml) C: Tổng số khuẩn lạc trờn cỏc đĩa
n1: Sốđĩa ở nồng độ pha loóng thứ nhất n2: Sốđĩa ở nồng độ pha loóng thứ hai d: Nồng độ pha loóng thứ nhất
2.2.4. Phương phỏp phõn tớch vi sinh vật gõy bệnh (E.coli): Theo phương phỏp nhiều ống và chỉ số MPN. phỏp nhiều ống và chỉ số MPN.
2.2.5. Xử lý bựn thải làm nguyờn liệu nuụi cấy: Bựn thải được xử lý theo phương phỏp thủy phõn. phương phỏp thủy phõn.
2.2.6. Phương phỏp lờn men chỡm trong điều kiện phũng thớ nghiệm: bựn thải sau khi xử lý được bổ sung một số thành phần dinh dưỡng (nito, cacbon, …), thải sau khi xử lý được bổ sung một số thành phần dinh dưỡng (nito, cacbon, …), khử trựng ở 1210C trong vũng 30 phỳt. Làm nguội, đưa vào bỡnh lờn men. Bổ sung dịch giống đó chuẩn bị sẵn. Tiến hành lờn men trong cỏc điều kiện nhiệt độ, pH, DO … thớch hợp.
2.2.7. Phương phỏp lấy mẫu và bảo quản mẫu:
Áp dụng TCVN 6663-13:2000 về Hướng dẫn lẫy mẫu bựn nước, bựn nước thải và bựn liờn quan, trong đú xỏc định mục tiờu lấy mẫu:
-Xỏc định thành phần vật lý, húa học và sinh học của mẫu bựn thải sinh học. -Xỏc định hiệu quả của phương phỏp xử lý bựn ỏp dụng.
Do đú, để xỏc định được đặc tớnh của bựn từ nguồn phỏt sinh đến cỏc cụng đoạn xử lý bựn, cỏc vị trớ lấy mẫu được lựa chọn bao gồm:
-Tại bể aeroten
-Tại bể thu bựn sau mỏy ộp bựn.
Cỏc mẫu được lấy là mẫu đơn (mẫu riờng lẻđược lấy một cỏch ngẫu nhiờn theo thời gian và/hoặc địa điểm) từ một khối bựn. Với mẫu bựn tại bể aeroten, tiến hành lấy mẫu như với mẫu nước. Tại bể chứa bựn, lấy mẫu tại vị trớ van xả bựn. Sau khi qua mỏy ộp bựn, mẫu được lấy tại thựng chứa. Tiến hành lấy mẫu và bảo quản mẫu theo tiờu chuẩn.
Mẫu được lấy định kỳ trong quỏ trỡnh lờn men ở fermentor, bảo quản trong tủ
lạnh ở 40C, phõn tớch mẫu trong vũng 24 giờ.
2.2.8. Phương phỏp nghiờn cứu:
2.2.8.1. Đỏnh giỏ loại bựn thải thớch hợp làm mụi trường nuụi cấy B. thuringiensis: thuringiensis:
Mỗi loại bựn thải cú tỷ lệ cỏc chất dinh dưỡng khỏc nhau, nờn ta cần tiến hành thớ nghiệm để tỡm loại bựn thớch hợp nhất làm nguyờn liệu nuụi cấy Bacillus thuringiensis. Thớ nghiệm được tiến hành như sau:
-TN1: sử dụng mụi trường MPB làm đối chứng(ĐC); -TN2: 10% bựn ở bểđiều hoà; -TN3: 10% bựn ở bể lắng; -TN4: 10% bựn ởđầu vào bể Aeroten; -TN5: 5% bựn sau ộp; -TN6: 20% bựn ở bể Aeroten;
Cỏc mẫu bựn pha loóng được điều chỉnh về pH = 7 rồi đem khử trựng tất cả cỏc mẫu ở nhiệt độ 121oC trong 15 phỳt.
Sau khi khử trựng, cỏc mẫu thớ nghiệm đuợc cấy giống theo tỷ lệ 1% thể tớch rồi
được nuụi cấy lắc 200 vũng/phỳt ở 30oC.
Tiến hành lấy mẫu phõn tớch ở cỏc thời điểm 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ để xỏc định số lượng tế bào vi khuẩn B.thuringiensis và đỏnh giỏ kết quả thu được.
2.2.8.2. Nghiờn cứu ảnh hưởng của phương phỏp tiền xử lý đến khả năng sinh trưởng và hỡnh thành bào tử của B.thuringiensis:
Trước khi sử dụng làm nguyờn liệu nuụi cấy vi sinh vật, cỏc mẫu bựn đuợc tiến hành tiền xử lý theo cỏc phương phỏp thuỷ phõn kết hợp với axit hoỏ hay kiềm hoỏ như sau:
-TN1: sử dụng mụi trường MPB làm mẫu đối chứng (ĐC) -TN2: Bựn thải đuợc điều chỉnh về pH = 2;
-TN3: Bựn thải đuợc điều chỉnh về pH = 7; -TN4: Bựn thải đuợc điều chỉnh đến pH = 9;
Cỏc mẫu bựn thải sau khi điều chỉnh về cỏc pH axit, trung tớnh và kiềm thỡ được thuỷ phõn ở điều kiện 121oC trong 15 phỳt. Sau đú, điều chỉnh lại pH của cỏc mẫu này và đem khử trựng tất cả cỏc mẫu ở 121oC trong 15 phỳt.
Sau khi tiến hành tiền xử lý, cỏc mẫu được bổ sung giống theo tỷ lệ 1% thể tớch,
đưa nuụi lắc 200v/p ở 30oC và tiến hành lấy mẫu kiểm tra tại cỏc thời điểm 0h, 12h, 24h, 36h và 48h.
2.2.8.3. Nghiờn cứu ảnh hưởng của tỷ lệ bựn lờn quỏ trỡnh sinh trưởng và hỡnh thành bào tử của B.thuringiensis: hỡnh thành bào tử của B.thuringiensis:
Bựn thải trước khi sử dụng cần được pha loóng để tỡm nồng độ thớch hợp cho quỏ trỡnh nuụi cấy, do đú ta tiến hành thớ nghiệm để xỏc định nồng độ pha loóng như
sau: -TN1: sử dụng mụi trường MPB làm mẫu đối chứng (ĐC); -TN2: mụi trường chứa 10% bựn thải; -TN3: mụi trường chứa 15% bựn thải; -TN4: mụi trường chứa 20% bựn thải; -TN5: mụi trường chứa 25% bựn thải;
Cỏc mẫu được khử trựng ở 121oC trong 15 phỳt, sau đú được bổ sung dịch giống theo tỷ lệ 1% thể tớch và tiến hành nuụi lắc 200 v/p ở 30oC. Lấy mẫu kiểm tra tại cỏc thời điểm 0h, 12h, 24h, 36h và 48h.
Tiến hành xỏc định số lượng tế bào, bào tử và đỏnh giỏ kết quả.
2.2.8.4. Nghiờn cứu ảnh hưởng của pH lờn quỏ trỡnh sinh trưởng và hỡnh thành bào tử của B.thurigiensis: thành bào tử của B.thurigiensis:
Bựn thải được tiền xử lý bằng phương phỏp thuỷ phõn kiềm, sau đú đuợc điều chỉnh về cỏc pH khỏc nhau như sau:
-TN1: sử dụng mụi trường MPB làm mẫu đối chứng (ĐC); -TN2: bựn thải được điều chỉnh đến pH = 5;
-TN3: bựn thải được điều chỉnh đến pH = 6; -TN4: bựn thải được điều chỉnh đến pH = 7;
-TN5: bựn thải được điều chỉnh đến pH = 8; -TN6: bựn thải được điều chỉnh đến pH = 9;
Cỏc mẫu được khử trựng ở 121oC trong 15 phỳt và bổ sung dịch giống theo tỷ
lệ 1% thể tớch. Sau đú đem nuụi lắc 200 v/p ở 30oC và lấy mẫu kiểm tra tại cỏc thời
điểm 0h, 12h, 24h, 36h và 48h.
Tiến hành xỏc định số lượng tế bào, bào tử và đỏnh giỏ kết quả thu được.
2.2.8.5. Nghiờn cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lờn quỏ trỡnh sinh trưởng, hỡnh thành bào tử của B. thurigiensis: thành bào tử của B. thurigiensis:
Bựn thải được tiền xử lý bằng phương phỏp thuỷ phõn kiềm, nồng độ bựn sử
dụng là 20%, pH = 7, khử trựng ở 121oC trong 15 phỳt. Sau đú bổ sung 1% theo thể
tớch dịch giống và tiến hành thớ nghiệm ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau như sau: -TN1: nuụi cấy mẫu ở 20oC;
-TN2: nuụi cấy mẫu ở 25oC; -TN3: nuụi cấy mẫu ở 30oC; -TN4: nuụi cấy mẫu ở 40oC; -TN5: nuụi cấy mẫu ở 45oC.
Cỏc mẫu được nuụi trong mỏy lắc ổn nhiệt 200 v/p và lấy mẫu kiểm tra tại cỏc thời điểm 0h, 12h, 24h, 36h và 48h.
Tiến hành xỏc định số lượng tế bào, bào tử và đỏnh giỏ kết quả thu đuợc.
2.2.8.6. Nghiờn cứu ảnh hưởng của thời gian lờn men đến quỏ trỡnh sinh trưởng, hỡnh thành bào tử của B. thuringiensis: trưởng, hỡnh thành bào tử của B. thuringiensis:
Bựn thải được tiền xử lý bằng phương phỏp thuỷ phõn kiềm, nồng độ pha loóng bựn là 20%, pH = 7.
Sau đú, bổ sung dịch giống theo tỷ lệ 1% thể tớch rồi nuụi lắc 200 v/p ở 30oC và lấy mẫu kiểm tra ở cỏc thời điểm 0h, 12h, 24h, 36h và 48h.
Tiến hành xỏc định số lượng tế bào, bào tử và đỏnh giỏ kết quả.
2.2.9. Kỹ thuật phõn tớch sinh học (bioassay Technique):
Đỏnh giỏ hoạt lực của dịch lờn men thụng qua khả năng diệt sõu hại của dịch lờn men, đồng thời so sỏnh với hoạt lực của sản phẩm Bt đang lưu hành trờn thị
trường:
Thử nghiệm độc tớnh sinh học của B. thuringiensis được tiến hành trờn sõu khoang với tờn khoa học là ở độ tuổi 2. Mỗi phương ỏn thớ nghiệm đuợc bố trớ như
sau:
5 gram thức ăn + lượng dịch nuụi cấy thớch hợp/10 sõu. Bổ sung lần lượt cỏc bỡnh với liều dịch 10% như sau:
-TN: bổ sung 10% dịch nuụi Bt trờn mụi trường bựn thải so với trọng lượng thức ăn.
-ĐC 1: bổ sung 10% dịch nuụi Bt trờn mụi trường MPB so với trọng lượng thức
ăn.
-ĐC 2: bổ sung 10% bựn thải bia so với trọng lượng thức ăn. -ĐC 3: bổ sung 10% nước mỏy so với trọng lượng thức ăn.
Bảo quản bỡnh nuụi tại nơi rõm mỏt, trỏnh ỏnh sỏng mặt trời trực tiếp. Kiểm tra số lượng sõu chết mỗi ngày, thớ nghiệm kộo dài 5-7 ngày.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đỏnh giỏ chất lượng bựn thải nhà mỏy bia Sài Gũn – Hà Nội: 3.1.1. Cụng nghệ xử lý nước thải, bựn thải:
Nhà mỏy bia Sài Gũn – Hà Nội ỏp dụng biện phỏp xử lý theo sơđồ sau:
Hỡnh 3.1. Sơđồ cụng nghệ xử lý nước thải nhà mỏy bia Sài Gũn – Hà Nội
Nước thải từ cỏc khõu sản xuất được gom lại và điều chỉnh pH trong bể điều hoà. Từ bểđiều hoà, nước thải lần lượt được dẫn sang cỏc bể xử lý yếm khớ và hiếu khớ. Cuối cựng, nước thải được dẫn sang bể lắng, tỏch bựn và nước. Nước thải đó xử
lý thải vào nguồn tiếp nhận, bựn thải được chuyển qua kột chứa bựn, mỏy ộp và
được đưa đến bói chụn lấp. Bể điều hoà UASB Bể Bể Aeroten Kột chứa bựn Tuần hoàn bựn Bể Lắng Dũng ra Bể Aeroten Chụn lấp Mỏy ộp bựn Dũng vào
3.1.2. Kết quả phõn tớch thành phần bựn:
Để khảo sỏt đặc tớnh bựn thải của hệ thống xử lý nước thải của Cụng ty bia Sài Gũn – Hà Nội, tụi tiến hành lấy mẫu ở cỏc vị trớ và tần suất như sau:
- Vị trớ lấy mẫu: lấy mẫu bựn thải tại bể lắng bựn của hệ thống xử lý nước thải Cụng ty bia Sài Gũn – Hà Nội.
- Tần suất lấy mẫu: 02 lần/thỏng.
Kết quả phõn tớch bựn thải nhà mỏy bia Sài Gũn – Hà Nội được trỡnh bày ở
bảng dưới đõy: Bựn bia Thụng số Đơn vị Đợt 1 Đợt 2 TOC g/kg 111,3 124,3 TS g/l 156,4 175,6 VS g/l 47,1 55,3 SS g/l 42 46 VSS g/l - - Độẩm % 91,3 89,2 pH - 8,0 8,1 TC % 73,6 72,42 TN % 5,3 5,39
N-NH4 mg/kg 186,2 252,6 TP mg/kg 127,6 115 PO43- mg/kg - - Al3+ mg/kg - - Ca2+ mg/kg - - Cd mg/kg 1,08 0,22 Cr mg/kg 104,6 135,3 Cu mg/kg 361,5 438,06 Fe mg/kg - - K mg/kg - - Mg mg/kg - - Mn mg/kg 439,4 659,1 Ni mg/kg 99,3 120,6 Pb mg/kg 8,5 13,2 Hg mg/kg 0,16 0,20 As mg/kg 60,3 75,6 Zn mg/kg - -
Kết quả phõn tớch đặc trưng của bựn thải nhà mỏy bia Sài Gũn – Hà Nội cho thấy: TOC của bựn trong 2 đợt lấy mẫu đều cao, dao động trong khoảng 111,3 - 124,3 g/kg; VS dao động trong khoảng 47,1 – 55,3%; TC trong khoảng 72,42 – 73,6%, N-NH4 dao động trong khoảng 186,2 – 252,6 g/kg.
Từ kết quả trờn, ta thấy được hàm lượng cỏc chất hữu cơ trong bựn thải sinh học tương đối cao. Vỡ vậy cú thể sử dụng bựn thải sinh học của nhà mỏy bia Sài Gũn – Hà Nội để làm nguyờn liệu thụ nuụi cấy vi sinh vật.
3.2. Kết quả nghiờn cứu đỏnh giỏ loại bựn thải thớch hợp làm nguyờn liệu nuụi cấy Bacillus thuringiensis. nuụi cấy Bacillus thuringiensis.
Sau khi tiến hành thớ nghiệm, chỳng tụi thu được kết quả như sau:
Mật độ tế bào (CFU/ml) Thời gian (h) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 0 10,9 . 104 2,6.104 1,5.104 1,2.104 4,6.104 1,7.104 24 2,3 . 108 1,2.106 2,9.106 7,9.106 2,2.106 4,8.107 48 1,2 . 108 1.105 1,1.106 6,2.106 6,5.106 4.107
Hỡnh 3.2. Kết quả nghiờn cứu đỏnh giỏ loại bựn thải thớch hợp làm nguyờn liệu nuụi cấy Bacillus thuringiensis
0.00E+00 5.00E+07 1.00E+08 1.50E+08 2.00E+08 2.50E+08 3.00E+08 3.50E+08 0 24 48 Thời gian (h) M ậ t độ t ế bà o ( C FU /m l) TN6 TN5 TN4 TN3 TN2 TN1
Từ kết quả thu được ở bảng 3.2 và hỡnh 3.2, ta nhận thấy: mật độ tế bào
Bacillus thuringiensis ở tất cả cỏc phương ỏn thớ nghiệm đều tăng dần theo thời gian và tăng nhanh trong giai đoạn 0 – 24h. Mật độ tế bào ở cỏc thớ nghiệm đều đạt tối đa sau 24h nuụi cấy, sau đú khụng tăng mà cú xu hướng giảm dần.
Riờng TN2 ( sử dụng 100% nước thải ở bể điều hũa), mật độ cực đại ở 24h chỉ đạt 1,2.106 CFu/ml, sau 48h giảm xuống chỉ cũn 1.105 CFU/ml. Điều này cho thấy hàm lượng dinh dưỡng trong bểđiều hũa quỏ thấp, khụng đủ cung cấp cho sự sinh trưởng và phỏt triển của Bt.
Trong hầu hết cỏc thớ nghiệm, mật độ tế bào chỉ đạt 106 CFU/ml sau 24h nuụi