Muối dùng để pha dung dịch đầu vào để sản xuất Anolit là muối có hàm lƣợng NaCl 99,8%.
Chất khử trùng đối chứng: Chất khử trùng đối chứng đƣợc chọn để so sánh với dung dịch Anolit là Clorin có công thức hóa học là Ca(ClO)2. Clorin hạt đƣợc pha vào nƣớc với liều lƣợng 1,6 g/l. Nồng độ Clo hoạt tính xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ iot với thuốc thử là Na2S2O3 0,1 N và chỉ thị hồ tinh bột.
Chất khử trùng thử nghiệm: Dung dịch Anolit đƣợc điều chế từ thiết bị HHĐH ở trạng thái làm việc bình thƣờng.
Thiết bị so màu bằng mắt chuyên dụng với thuốc thử DPD của hãng HACH (Mỹ) để kiểm tra khả năng xác định nồng độ Clo hoạt tính trong nƣớc từ 0,1 đến 3,0 mg/l với độ chính xác 0,1 mg/l.
Lớp KTMT 2012B Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường 28
2.1.4. Lựa chọn các đối tượng khử trùng và các vi khuẩn xét nghiệm
Đối tƣợng dùng cho thử nghiệm là mặt bàn, gạch ceramic, rổ, thớt là các dụng cụ sản xuất của xí nghiệp đƣợc lấy ngẫu nhiên sau ca sản xuất. Găng tay công nhân đƣợc chọn ngẫu nhiên trong số các công nhân đang trong quá trình sản xuất. Các thùng chậu để ngâm dụng cụ đối tƣợng khử trùng đƣợc lấy ngẫu nhiên tại các xí nghiệp.
Vi khuẩn đƣợc lựa chọn để xét nghiệm: Coliforms, E.coli, tổng vi khuẩn hiếu khí và Staphylococcus.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu
Nghiên cứu các tài liệu liên quan đến điện phân, công nghệ hoạt hóa điện hóa, công nghệ vi sinh.
Nghiên cứu tài liệu liên quan đến tình hình nhiễm khuẩn trong thực phẩm và các hóa chất khử trùng trong thực phẩm.
2.2.2. Phương pháp thực hiện thử nghiệm trong phòng thí nghiệm
2.2.2.1. Xác định độ ổn định của dung dịch Anolit theo thời gian.
Chất lƣợng của dung dịch Anolit đƣợc kiểm soát qua các thông số lí – hóa cơ bản nhƣ: pH, thế ôxy hóa khử ORP, nồng độ Clo hoạt tính, tổng chất rắn hòa tan TDS. Hệ thống vận hành liên tục từ 7 giờ sáng đến 16 giờ cùng ngày. Lấy mẫu phân tích Anolit đƣợc thực hiện 1 giờ, 2 giờ, 3, 4, 7 và 8 giờ sau khi chạy máy.
2.2.2.2. Xác định khả năng diệt khuẩn của Anolit
Bố trí thí nghiệm:
Chuẩn bị dung dịch Anolit (dung dịch A) theo các thông số cơ bản sau: pH = 6,5; Thế ôxy hóa khử (ORP) = 800 mV; Nồng độ chất ôxy hóa (tính theo Clo hoạt tính) lần lƣợt là 0; 0,1; 0,25; 0,5; 1 mg/l.
Chuẩn bị dịch hỗn hợp E.coli mật độ 104 CFU/ml và Coliforms mật độ 105 CFU/ml (dịch B).
a. Xác định nồng độ tối ƣu chất khử trùng
Lớp KTMT 2012B Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường 29
- Bổ sung 1ml dịch gốc, lắc đều, rồi để trong thời gian 5 phút.
- Bổ sung 0,2 ml Na2S2O3 0,1N, lắc đều trong 30 giây để khử Clo dƣ.
- Xác định mật độ E.coli và Coliforms còn lại trong dung dịch. b. Xác định thời gian diệt khuẩn của Anolit
- Cho 9 ml dung dịch A nồng độ 0,5 mg/l tiếp xúc với 1 ml dịch B với thời gian tiếp xúc lần lƣợt là 10 giây; 30 giây; 1 phút; 5 phút.
- Sau đó khử Clo dƣ bằng Na2S2O3 0,1 N rồi xác định mật độ E.coli và Coliforms còn lại trong dung dịch.
Mỗi thí nghiệm đều đƣợc lặp lại 10 lần (kí hiệu là mẫu 1, mẫu 2, …, mẫu 10)
2.2.3. Phương pháp thực hiện các thử nghiệm tại hiện trường
Các thử nghiệm đƣợc thực hiện ngay tại nơi đang sản xuất của nhà máy. Các qui trình thực hiện thử nghiệm đều đƣợc thực hiện theo qui trình thông thƣờng của nhà máy.
2.2.3.1. Khảo sát thực trạng nhiễm khuẩn môi trường trong cơ sở chế biến thủy sản
Sau ca sản xuất, lấy ngẫu nhiên 2 găng tay cao su, 2 rổ nhựa, 2 thớt nhựa, 2 chậu nhựa, 1 bàn inox và chọn 2 viên gạch ceramic có vị trí cách xa nhau. Các dụng cụ và bề mặt môi trƣờng trên đã đƣợc vệ sinh qua bằng nƣớc rửa bát cho sạch các chất hữu cơ. Tiến hành lấy mẫu bề mặt bằng tăm bông trên diện tích 50 cm2 (riêng găng tay cao su lấy mẫu trên diện tích 25 cm2
). Bàn inox lấy ở 2 vị trí: 1 ở đầu bàn, 1 ở giữa bàn.
2.2.3.2. Ngâm khử trùng các dụng cụ nhỏ
Phân tích vi sinh mỗi dụng cụ 80 mẫu bao gồm các chỉ tiêu vi khuẩn: tổng VKHK, Coliforms, E.coli và Staphylococcus.
Các mẫu gồm có: 20 mẫu trƣớc khử trùng, 20 mẫu sau khử trùng bề mặt dụng cụ đƣợc vệ sinh khử trùng theo phƣơng pháp khử trùng thƣờng qui; 20 mẫu trƣớc khử trùng, 20 mẫu sau khử trùng bề mặt dụng cụ đƣợc vệ sinh khử trùng theo phƣơng pháp mới sử dụng Anolit (và đƣợc chia đều thành 2 đợt thí nghiệm).
2.2.3.2.1. Khử trùng và lấy mẫu trên rổ nhựa
Lớp KTMT 2012B Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường 30
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Sau ca sản xuất, chọn 10 rổ đã đƣợc sử dụng và đánh số từ 1 đến 10. Lấy mẫu bề mặt trên diện tích 50 cm2
rổ nhựa sau khi đƣợc vệ sinh qua thiết bị chà rửa bằng tia nƣớc áp lực cao. Dùng tăm bông đã tiệt trùng quệt đều trên diện tích lấy mẫu và đƣa vào ống nghiệm đựng 10 ml nƣớc muối sinh lý đã tiệt trùng. Đặt ống nghiệm vào thùng lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm để bảo quản và phân tích trong ngày.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trƣớc khử trùng, rổ sẽ đƣợc ngâm vào thùng chứa dung dịch Clorin nồng độ 100 mg/l (Clo hoạt tính) trong thời gian 5 phút. Sau đó tráng rửa rổ nhựa dƣới vòi nƣớc chảy mạnh trong thời gian 1 phút rồi tiến hành lấy mẫu sau khử trùng nhƣ đã trình bày ở trên.
b. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng bằng dung dịch siêu ôxy hóa (Anolit)
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở mục a.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trƣớc vệ sinh, các rổ nhựa đƣợc chà rửa bằng bàn chải nhựa trong dung dịch Anolit (100 mg/l Clo hoạt tính) có thêm chất tẩy rửa (nƣớc rửa bát (1%)) trong thời gian 1 phút. Sau đó ngâm các rổ nhựa vào dung dịch Anolit (100 mg/l) trong thời gian 5 phút. Sau khi tráng rửa các rổ nhựa dƣới vòi nƣớc chảy mạnh cho sạch, tiến hành lấy mẫu sau khử trùng tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở phần trên.
Mỗi thí nghiệm đều đƣợc lặp lại 2 lần vào các thời điểm khác nhau.
2.2.3.2.2. Khử trùng và lấy mẫu trên thớt nhựa
a. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng thường qui
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Lấy 10 thớt nhựa từ các công nhân vừa làm sản phẩm sau ca sản xuất và đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Làm vệ sinh các thớt đã chọn bằng cách chà sát trong nƣớc xà phòng trong thời gian 5 phút. Tráng rửa lại các thớt dƣới vòi nƣớc chảy mạnh. Lấy mẫu trƣớc khử trùng các bề mặt mỗi thớt tƣơng tự nhƣ lấy mẫu rổ nhựa với diện tích lấy mẫu 50cm2.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trƣớc khử trùng, các thớt nhựa đã chọn đƣợc ngâm vào thùng nƣớc thứ nhất có pha Clorin nồng độ 100 mg/l Clo hoạt tính (có pha thêm 1% nƣớc rửa bát), sau đó chà rửa bằng bàn chải
Lớp KTMT 2012B Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường 31
cho sạch các chất hữu cơ. Sau khi chà rửa, thớt đƣợc mang đi tráng rửa lại dƣới vòi nƣớc chảy mạnh cho sạch xà phòng. Sau đó, ngâm các thớt vào thùng nƣớc thứ 2 có pha Clorin nồng độ 100 mg/l Clo hoạt tính, trong thời gian 5 phút. Sau khi lấy thớt ra khỏi thùng nƣớc khử trùng, tráng rửa lại dƣới vòi nƣớc chảy mạnh, tiến hành lấy mẫu sau khử trùng các bề mặt mỗi thớt theo phƣơng pháp đã mô tả ở mục trên.
b. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng bằng dung dịch Anolit
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở mục a.
Lấy mẫu sau khử trùng: Qui trình tiến hành vệ sinh bề mặt thớt nhựa tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp khử trùng thƣờng qui (chỉ thay Clorin bằng dung dịch ANK).
Mỗi thí nghiệm đều đƣợc lặp lại 2 lần vào các thời điểm khác nhau.
2.2.3.2.3. Khử trùng và lấy mẫu trên bề mặt chậu nhựa a. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng thường qui
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Sau ca sản xuất, lấy 10 chậu nhựa đã qua sử dụng đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Dùng bàn chải nhựa cọ rửa các chậu nhựa trong nƣớc xà phòng. Tráng qua các chậu nhựa trong dòng nƣớc chảy cho hết xà phòng và lấy mẫu bề mặt các chậu nhựa trƣớc khử trùng theo cách tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở phần trên với diện tích lấy mẫu 50 cm2
.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trƣớc khử trùng, các chậu nhựa đƣợc công nhân vệ sinh theo cách thƣờng qui: Chậu đƣợc ngâm vào thùng chứa xà phòng, đặt các chậu lên băng chuyền chạy qua thiết bị cọ rửa tự động. Ngâm các chậu nhựa vào thùng chứa Clorin trong thời gian 5 phút. Sau đó, các chậu nhựa đƣợc tráng rửa bằng nƣớc sạch tại vòi nƣớc chảy và lấy mẫu sau khử trùng bề mặt bên trong của từng chậu theo cách tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở phần trên.
b. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng bằng dung dịch Anolit
Lớp KTMT 2012B Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường 32
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trƣớc khử trùng, các chậu nhựa đƣợc chà rửa bằng bàn chải nhựa trong dung dịch Anolit (nồng độ 100 mg/l) có thêm chất tẩy rửa (nƣớc rửa bát (1%)). Sau khi tráng qua nƣớc cho hết chất tẩy rửa, ngâm các chậu nhựa vào dung dịch Anolit (100 mg/l) trong thời gian 5 phút. Sau khi tráng rửa các chậu nhựa dƣới vòi nƣớc chảy mạnh, tiến hành lấy mẫu sau khử trùng tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở phần trên.
Mỗi thí nghiệm đều đƣợc lặp lại 2 lần vào các thời điểm khác nhau.
2.2.3.2.4. Khử trùng và lấy mẫu trên găng tay cao su a. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng thường qui
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Công nhân sau khi làm xong mang găng tay về nhà tự làm vệ sinh. Mang đến nhà máy, nhúng qua nƣớc sạch và lấy mẫu trƣớc khử trùng trên 10 găng tay. Lấy mẫu trên bề mặt găng với diện tích 25 cm2 tƣơng tự nhƣ lấy mẫu rổ nhựa.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trƣớc khử trùng, cọ sạch bằng xà phòng, ngâm qua Clorin (100 mg/l) trong 5 phút. Nhúng qua nƣớc sạch, rồi tiến hành lấy mẫu sau khử trùng tƣơng tự nhƣ đối với rổ nhựa đã trình bày ở phần trên.
b. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng bằng dung dịch Anolit
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở mục a.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trƣớc khử trùng, nhúng găng tay vào dung dịch Anolit có pha thêm chất tẩy rửa (nƣớc rửa bát (1%)). Dùng bàn chải cọ sạch, tráng qua nƣớc sạch. Sau đó, ngâm qua dung dịch Anolit (nồng độ 100 mg/l) trong thời gian 5 phút. Tráng rửa lại dƣới vòi nƣớc chảy mạnh, rồi lấy mẫu bề mặt sau khử trùng với diện tích 25 cm2 tƣơng tự nhƣ lấy mẫu rổ nhựa.
2.2.3.3. Khử trùng bề mặt lớn
2.2.3.3.1. Khử trùng và lấy mẫu trên bề mặt thép inox a. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng thường qui
Lớp KTMT 2012B Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường 33
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Chuẩn bị 5 bàn inox sau ca sản xuất. Trƣớc tiên mặt bàn đƣợc thu dọn hết các sản phẩm thừa, sau đó đƣợc cọ rửa bằng nƣớc xà phòng, dội sạch bằng nƣớc. Lấy mẫu bề mặt tại 2 vị trí (một ở đầu bàn, một ở giữa bàn) với diện tích lấy mẫu là 50 cm2 bằng tăm bông vô trùng.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trƣớc khử trùng, mặt bàn đƣợc lau bằng nƣớc pha Clorin có nồng độ Clo hoạt tính 100 mg/l. Sau đó, tráng rửa bằng nƣớc sạch và lấy mẫu sau khử trùng bề mặt theo cách tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở phần trên với diện tích lấy mẫu 50 cm2.
b. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng sử dụng dung dịch Anolit
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Qui trình tƣơng tự nhƣ trình bày ở mục a.
Lấy mẫu sau khử trùng: làm tƣơng tự nhƣ với khử trùng thƣờng qui (thay Clorin bằng Anolit có nồng độ Clo hoạt tính 100 mg/l).
2.2.2.3.2. Khử trùng và lấy mẫu trên bề mặt gạch ceramic a. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng thường qui
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Chọn 10 viên gạch Ceramic, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Lấy mẫu bề mặt trên từng viên gạch làm mẫu trƣớc khử trùng với diện tích lấy mẫu là 50 cm2.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trƣớc khử trùng, các viên gạch đƣợc chà rửa bằng xà phòng, khử trùng bằng nƣớc pha Clorin có nồng độ Clo hoạt tính 100 mg/l. Sau đó, dội lại bằng nƣớc sạch và lấy mẫu sau khử trùng bề mặt theo cách tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở phần trên.
b. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng sử dụng dung dịch Anolit
Lấy mẫu trƣớc khử trùng: Qui trình tƣơng tự nhƣ trình bày ở mục a.
Lấy mẫu sau khử trùng: Phƣơng pháp khử trùng tƣơng tự nhƣ khử trùng thƣờng qui (thay Clorin bằng dung dịch Anolit có nồng độ Clo hoạt tính là 100 mg/l). Lấy mẫu sau khử trùng trên diện tích 50 cm2.
2.2.4. Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm vi sinh
- Phƣơng pháp lấy mẫu vi sinh tại Xí nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu 1 (F34) – Công ty BASEAFOOD, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu đƣợc thực hiện theo hƣớng
Lớp KTMT 2012B Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường 34
dẫn lấy mẫu vệ sinh công nghiệp trong “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản”. SEAQIP, Nhà xuất bản Nông nghiệp 2004.
- Các mẫu vi sinh khử trùng bề mặt dụng cụ và môi trƣờng trong chế biến thực phẩm đƣợc lấy theo phƣơng pháp dùng tăm bông trên bề mặt xác định.
Các bước lấy mẫu:
+ Dùng cồn khử trùng tay
+ Đặt khuôn lấy mẫu đã khử trùng lên bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm (khuôn lấy mẫu là bản kim loại khoét lỗ ở giữa với diện tích là 25cm2, hoặc 50cm2 tùy theo bề mặt cần lấy mẫu là lớn hay nhỏ).
+ Dùng tăm bông vô trùng quét đều mặt diện tích trong của khuôn.
+ Sau khi quét xong, thao tác gần ngọn lửa đèn cồn, mở nắp ống nghiệm và nhanh chóng cho tăm bông vào. Nút ống nghiệm lại (chú ý không để tăm bông chạm vào miệng ống nghiệm.
+ Cho ống nghiệm chứa tăm bông đã lấy mẫu vào một túi PE vô trùng. Ghi các thông tin về vị trí lấy mẫu vào thẻ nhận diện. Cho thẻ vào túi chung với ống mẫu. Cột kín miệng túi bằng dây thun hoặc bằng ghim bấm.
+ Cho túi mẫu vào thùng cách nhiệt. Cho đá khô phủ quanh túi mẫu.
- Việc lấy mẫu xét nghiệm vi sinh đƣợc thực hiện của hai bên thử nghiệm: cán bộ kỹ thuật của Xí nghiệp và ngƣời thực hiện đề tài.
2.2.5. Phương pháp phân tích vi sinh
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng đặc hiệu bằng phƣơng pháp đĩa thạch: + Sử dụng môi trƣờng PCA (Merck) để định lƣợng khuẩn lạc tổng vi khuẩn hiếu khí.
+ Sử dụng môi trƣờng Chromocult (Merck) để định lƣợng khuẩn lạc Coliforms và E.coli.
+ Sử dụng môi trƣờng Violet Red Bile (VRB) (Merck) để định lƣợng khuẩn lạc Coliforms.
+ Sử dụng môi trƣờng Eosin Methylene Blue (EMB) (Merck) để định lƣợng khuẩn lạc E.coli.
Lớp KTMT 2012B Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường 35
+ Sử dụng môi trƣờng Baird-parker agar (Merck) để định lƣợng khuẩn lạc
Staphylococus.
+ Sử dụng môi trƣờng SS agar để định lƣợng khuẩn lạc Salmonella.
Phân tích các mẫu bề mặt: Coliforms theo NM 44-2001, E.coli theo NMKL