4.3.1. Xác định hàm lƣợng tyrosine và hàm lƣợng đạm amine sinh ra theo thời gian thủy phân
Để tăng hiệu suất và hiệu quả của quá trình thủy phân enzyme trên cơ chất, tiến hành thí nghiệm đối kéo dài thời gian thủy phân đối với cặp tỉ lệ E/S tối ƣu (1,8 mgE/1,3629 gPro). Và kết quả thí nghiệm nhƣ sau:
Bảng 4.3. Hàm lƣợng tyrosine và đạm amine theo thời gian Thời gian thủy phân
(phút) Hàm lƣợng Tyrosine (mg/gPro) Hàm lƣợng đạm amine (mg/gNL) 30 0,736a 1,625a 60 0,959b 2,094b 90 1,026c 2,505c 120 1,077d 2,677d 180 1,126e 2,839e 240 1,161f 3,014f
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%)
Qua bảng số liệu cho thấy, khi tăng thời gian lên thì khả năng thủy phân của enzyme cũng tăng theo. Điều đó đƣợc thể hiện thông qua sự tăng của hàm lƣợng tyrosine và hàm lƣợng đạm amine sinh ra trong quá trình thủy phân, nhƣng chỉ tăng nhanh trong giai đoạn đầu và thời gian thủy phân càng dài về sau thì tăng chậm hơn. Thật vậy, điều này có thể đƣợc giải thích khi thời gian thủy phân càng dài thì hoạt tính thủy phân của enzyme càng giảm, do trong quá trình thủy phân các phân tử protein bị phân cắt thành acid amine và các peptide có trọng lƣợng phân tử thấp hòa tan trong dung dịch, chính những nhân tố này là chất ức chế hoạt tính của enzyme nên thời gian thủy phân càng dài thì hoạt tính của enzyme càng giảm (Nguyễn Xuân Trình và cộng sự., 2013). Ngoài ra, bản thân enzyme là một protein nên có thể tự thủy phân làm cho hoạt tính thủy phân giảm dần theo thời gian (Tạ Hùng Cƣờng, 2014).
Kết quả ở thời gian thủy phân là 240 phút với hàm lƣợng Tyrosine sinh ra tƣơng ứng là 1.161 gTyr/100gPro (tƣơng đƣơng với 0,799 gTyr/100g căn bản khô). Kết quả này có sự khác biệt so với báo cáo của Suthasinee Nilsang
et al., (2004) ở điều kiện thủy phân tối ƣu của enzyme Flavourzyme sau 6 giờ thủy phân cho hàm lƣợng Tyrosine sinh ra ở cơ chất thịt cá và protein thịt cá lần lƣợt là 0,39 và 0,4 gTyr/100g căn bản khô. Và nghiên cứu của Mahmoudreza Ovissipour et al., (2009) về khả năng thủy phân của enzyme alcalase trên nội tạng của cá Tuyết cho hàm lƣợng Tyrosine 0,77 g Tyr/100 gPro. Hơn nữa, một nghiên cứu của Mahmoudreza Ovissipour et al., (2010) cho thấy thành phần Tyrosine của protein thủy phân từ đầu cá Ngừ vây vàng bằng enzyme Alcalase và Protamex tƣơng ứng là 2,54 và 1,67 gTyr/100gPro trong 24 giờ thủy phân. Đồng thời, kết quả này có sự khác biệt so với nghiên cứu của Tạ Hùng Cƣờng (2014) về hàm lƣợng tyrosine sinh ra khi dùng enzyme bromelain thủy phân thịt dè cá tra ở 240 phút là 0,919 gTyr/100gPro.
4.3.2. Tính hiệu suất thủy phân
4.3.2.1. Tính hiệu suất thủy phân theo hàm lượng tyrosine sinh ra
Hàm lƣợng tyrosine tổng đƣợc xác định bằng cách thủy phân hoàn toàn 1gPro bằng acid HCl 6N ở 110oC trong 24 giờ theo phƣơng pháp của ZHU Xian et al., (2008) cho kết quả là 2,3867 gTyr/100g (căn bản khô) (tƣơng đƣơng với 3,4576 gTyr/100gPro). Kết quả thí nghiệm này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Tran Trung Tuan (2010) về phụ phẩm cá tra có hàm lƣợng tyrosine tổng là 2,4 gTyr/100gPro (căn bản khô) và một nghiên cứu khác của Ghaly AE et al., (2013) về hàm lƣợng tyrosine trên phụ phẩm cá nƣớc ngọt cũng cho hàm lƣợng tyrosine tổng là 2,4 gTyr/100g (căn bản khô). Đồng thời cũng phù hợp với một nghiên cứu của Mahmoudreza Ovisspour et al., (2009) thì hàm lƣợng Tyrosine tổng trong nội tạng cá tuyết là 2,34 gTyr/100g (căn bản khô).
Theo kết quả nghiên cứu của Soottawat Benjakul và Micheal T. Morrissey (1997) thì hiệu suất thủy phân của enzyme có thể tính bằng hàm lƣợng amino acid sinh ra khi thủy phân tại một thời điểm bất kỳ trên hàm lƣợng amino acid tổng trong cùng một khối lƣợng cơ chất. Trong quá trình thủy phân thì hoạt tính thủy phân của enzyme đƣợc xác định bằng hàm lƣợng tyrosine sinh ra mà nó là một amino acid. Vì vậy, có thể tính hiệu suất thủy phân dựa vào hàm lƣợng tyrosine do enzyme thủy phân sinh ra trên hàm lƣợng tyrosine tổng trong cùng một đơn vị khối lƣợng. Và kết quả hiệu suất thủy phân tính theo hàm lƣợng Tyrosine đƣợc thể hiện thông qua đồ thị sau:
Hình 4.2. Đồ thị thể hiện hiệu suất thủy phân của enzyme Bromelain theo hàm lƣợng tyrosine.
4.3.2.2. Hiệu suất thủy phân theo phần trăm đạm amine.
Trong quá trình thủy phân cơ thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain thì sản phẩm tạo thành là các amino acid và những peptide mạch ngắn. Những amineo acid và các peptide mạch ngắn này có khả năng phản ứng tạo phức chất với dung dịch OPA và đƣợc hấp thụ ở bƣớc sóng 340 nm. Từ độ hấp thụ đó xác định đƣợc hàm lƣợng đạm amine, từ đó xác định đƣợc hiệu suất thủy phân của enzyme bằng đạm amine/ đạm tổng số (Nielsen P.M et al., 2001). Kết quả hiệu suất thủy phân tính theo hàm lƣợng đạm amine đƣợc thể hiện thông qua đồ thị sau:
Hình 4.3. Đồ thị thể hiện hiệu suất thủy phân của enzyme Bromelain theo hàm lƣợng đạm amine. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 H iệu suất t hủ y ph ân (% ) Thời gian (phút)
Hiệu suất (%Tyr)
1,8/1,3629 (mgE/gPro) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 H iệu suất th ủ y p h ân (% ) Thời gian (phút)
Hiệu suất (%N)
1,8/1,3629 (mgE/gPro)Tƣơng ứng với sự tăng của hàm lƣợng tyrosine và hàm lƣợng đạm amine thì hiệu suất của quá trình thủy phân cũng tăng theo khi kéo dài thời gian thủy phân nhƣng tăng nhanh trong giai đoạn đầu của quá trình, còn về sau thì hiệu suất của quá trình thủy phân cũng tăng nhƣng không nhiều khi kéo dài thời gian thủy phân. Kết quả cho thấy, ở 30 phút đầu thì hiệu suất thủy phân tính theo hàm lƣợng Tyrosine và đạm amine tƣơng ứng là 21,291% và 4,919%, nhƣng ở 90 phút thủy phân thì hiệu suất thủy phân tăng hơn 1,5 lần tƣơng ứng là 29,660% và 7,582%. Bên cạnh đó thì sau 90 phút, hiệu suất thủy phân cũng tăng lên nhƣng không đáng kể. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Tạ Hùng Cƣờng (2014) khi nghiên cứu quá trình thủy phân protein trên nguyên liệu thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain và nghiên cƣu của Mahmoudreza Ovissipour et al., (2010) cho thấy quá trình thủy phân phụ phẩm đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme alcalase và Protamex trong 4 giờ, hiệu suất thủy phân gia tăng theo thời gian thủy phân nhƣng chỉ tăng nhanh trong 2 giờ đầu tiên và sau đó cũng có sự gia tăng của hiệu suất thủy phân nhƣng tƣơng đối chậm. Đồng thời, tƣơng ứng với dự đoán của Guérard et al., (2002) về tỷ lệ tăng hiệu suất thủy phân giảm so với sự tăng thời gian thủy phân có thể là do sự hoạt động của enzyme bị ức chế bởi sự hình thành của các sản phẩm phản ứng khi hiệu suất thủy phân cao. Cụ thể ở thời gian 240 phút thì hiệu suất thủy phân tính theo hàm lƣợng Tyrosine đạt 33,571% (kết quả này gần nhƣ phù hợp với nghiên cứu của Rasa Slizyte et al., (2005) thì hiệu suất thủy phân protein từ phụ phẩm cá Tuyết theo amino acid bởi enzyme alcalase đạt 34,9% và kết quả nghiên cứu của Mahmoudreza Ovissipour et al., (2010) sau 24 giờ thủy phân thì hiệu suất thủy phân của enzyme alcalase trên cơ chất đầu cá ngừ vây vàng là 34%) và hiệu suất tính theo hàm lƣợng đạm amine là 9,192% phù hợp với nghiên cứu của Nabil Souissi et al., (2007) thì hiệu suất thủy phân từ phụ phẩm cá Trích theo phần trăm đạm amine bởi enzyme alcalase là 10,16%.
Qua đó, có thể kết luận rằng thời gian thủy phân tối ƣu cho quá trình thủy phân của enzyme bromelain trên cơ chất thịt dè cá tra đƣợc tách béo là 90 phút. Kết quả này có sự khác biệt so với nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Trúc và cộng sự., (2014) khi nghiên cứu thời gian thủy phân của enzyme bromelain thân khóm trên cơ chất máu cá tra là 32 giờ. Nhƣng lại có sự tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của Lê Văn Thảo (2003) khi nghiên cứu khả năng thủy phân của enzyme bromelain trên cơ chất bột ốc đạt hiệu suất thủy phân cao nhất trong khoảng 100-200 phút. Đồng thời, nghiên cứu của Trần Đình Cảnh (2010) cũng ghi nhận thời gian thủy phân tối ƣu cho enzyme bromelain thủy phân phế liệu đầu tôm là 2,5 giờ.
4.3.3. Hình ảnh điện di của sản phẩm thủy phân
Sau khi xác định đƣợc cặp tỉ lệ E/S tối ƣu của enzyme, dung dịch cơ chất đƣợc thủy phân tối ƣu là 90 phút. Dung dịch sau khi thủy phân đƣợc đem chạy điện di với gel polyacrylamide 10%, dung dịch protein chạy điện di đƣợc đƣa về cùng nồng độ 2,5 mg/ml. Mục đích của chạy điện di để xem sự phân bố hình thành peptide, những enzyme nào thủy phân hiệu quả thì sản phẩm là những acid amine và peptide có trọng lƣợng phân tử thấp, khi chạy điện di sẽ di chuyển về phía dƣới đáy hình điện di. Hình ảnh chạy điện di của dung dịch thủy phân của enzyme bromelain đƣợc thể hiện ở các hình bên dƣới.
Hình 4.4. Hình ảnh chạy điện di của dịch thủy phân bằng enzyme Bromelain
Ghi chú: cột 1: dung dịch ban đầu, cột 2, 3: dung dịch thủy phân 30 và 90 phút.
Qua Hình 4.4 cho thấy, dung dịch protein ban đầu chƣa thủy phân có trọng lƣợng phân tử lớn từ 15- 250 kDa. Sau 30 phút, dung dịch thủy phân có trọng lƣợng phân khoảng 15 kDa và sau đó ở thời điểm 90 phút thủy phân thì lƣợng phân tử khoảng 10 kDa. Kết quả này tƣơng đối phù hợp với nghiên cứu của Tạ Hùng Cƣờng (2014) cho kết quả chạy điện di dịch thủy phân của nguyên liệu thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain là sau 30 phút thủy phân thì trọng lƣợng phân tử của mạch peptide trong dung dịch thủy phân nhỏ hơn 15 kDa và thời gian thủy phân càng dài thì trọng lƣợng phân tử càng giảm.
Chƣơng V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Sau khi khảo sát quá trình thủy phân của enzyme bromelain trên cơ chất thịt dè cá tra đã đƣợc tách một phần béo. Đề tài có những kết luận nhƣ sau:
Enzyme bromelain có vận tốc phản ứng cực đại (Vmax) và hằng số tốc độ phản ứng (Km) lần lƣợt là 0,6487 (mol Tyr/phút) và 0,0964 gPro.
Với tỉ lệ E/S là 1,8 mgE/1,3629 gPro thì enzyme bromelain có khả năng thủy phân tốt nhất với hàm lƣợng tyrosine và đạm amine sinh ra lần lƣợt là 0,709 g/100gPro và 1,604 mg/gNL.
Ở thời gian 90 phút thì enzyme bromelain cho khả năng thủy phân tốt
nhất với hiệu suất thủy phân tính theo hàm lƣợng tyrosine là 29,660% và hiệu
suất thủy phân tính theo hàm lƣợng đạm amine là 7,582%.
Đồng thời, hàm lƣợng lipid có trong thành phần nguyên liệu có ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân của enzyme bromelain.
5.2. ĐỀ NGHỊ
Sau quá trình thực hiện thí nghiệm, có một số đề nghị sau: Tăng thời gian thủy phân của enzyme.
Từ các điều kiện thủy phân trên, khảo sát thêm các điều kiện sấy phun sản xuất ra sản phẩm bột đạm hiệu quả nhất.
Ứng dụng bổ sung bột protein thủy phân vào các sản phẩm thực phẩm. Khảo sát song song thí nghiệm trên nguyên liệu thịt dè chƣa tách béo với thịt dè đã tách hoàn toàn béo để biết rõ hơn sự ảnh hƣởng của hàm lƣợng béo đến khả năng thủy phân của enzyme bromelain.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt:
Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng (1996). Công Nghệ Chế Biến Thực Phẩm Thủy Sản, tập I Nguyên liệu chế biến thủy sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (2006). Nguyên liệu chế biến thủy sản. NXB Nông Nghiệp.
Nguyễn Đức Lƣợng (2004). Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP HCM.
Nguyễn Xuân Trình, Trần Hải Yến, Trần Thị Anh Thƣ (2013). Nghiên cứu công nghệ sản xuất dịch đạm và bột đạm.
Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị Áng (2000). Hóa sinh học. Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội.
Lê Ngọc Tú (2003). Hóa học thực phẩm. NXB Khoa học Kỹ Thuật.
Trần Đình Cảnh et al., (2010). Nghiên cứu chế độ thủy phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme. Viện nghiên cứu Hải Sản. Bản tin quý số 15 tháng 1-2010. Nguyễn Thị Thanh Trúc và cộng sự., (2010). Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng thủy phân máu cá Tra sử dụng Bromelain trích ly từ thân khóm. Đề tài nghiên cứu khoa học. Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Lê Văn Thảo (2003). Khảo sát khả năng ứng dụng của enzyme Bromelain để thủy phân protein. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ. Khoa Nông Nghiệp. Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Công Hà và Nguyễn Thị Thu Thủy (2013). Giáo trình Thực tập Hóa học Thực phẩm. Đại học Cần Thơ.
Tạ Hùng Cƣờng (2014). Nghiên cứu chế biến bột protein thủy phân từ thịt Dè cá Tra. Luận văn tốt nghiệp cao học
Tiếng Anh:
Rainboth, W.J (1996). Fishes of the Cambodian Mekong. FAO Species Identification Field Guide for Fishery Purposes. FAO, Rome, 265 p.
Min –Tian Gao, MaKaTo Hirata, Eiichi Toorisaka, Tadashi Hano (2005). Acid hyprolysis of fish wastes for lactic acid fermentation. Bioresource Technology 97 (2006): 2414 –2420.
Murachi. T (1970). Method enzymol. 19, 273-284.
AOAC (1990). Official methods of analysis (15th ed.). Washington, DC: Association of Official Analytical Chemists.
Tran Trung Tuan (2010). Tra Catfish (Pangasius Hypophthalmus) Residue Meals As Protein Sources for Growing Pigs. Swedish University of Agricultural Sciences Department of Animal Nutrition and Management., 978- 86197-99-5.
Polaina J, MacCabe AP (2007). Industrial enzymes: Structure, function and applications.
Mahrokh Nemati et al,. (2012). A Study on the Properties of Alosa (Alosa caspia) By-Products Protein Hydrolysates Using Commercial Enzymes. World Applied Sciences Journal 18 (7): 950-956
Mahmoudreza Ovissipoura, Abdolmohammad Abedian, Ali Motamedzadegan, Barbara Rasco, Reza Safari, Hoda Shahiri (2009). The effect of enzymatic hydrolysis time and temperature on the properties of protein hydrolysates from Persian sturgeon (Acipenser persicus) viscera. Food Chemistry 115: 238–242.
Mahmoudreza Ovissipour et al., (2010). Fish protein hydrolysates production from yellowfin tuna Thunnus albacareshead using Alcalase and Protamex. Int Aquat Res (2010) 2: 87-95.
Nabil Souissi et al., (2007). Biochemical and Functional Properties of Sardinella (Sardinella aurita) By-Product Hydrolysates. Food Technol. Biotechnol. 45(2) 187–194 (2007).
Guerard F et al., (2002). Production of tuna waste hydrolysates by a commercial neutral protease preparation. J Molec Catal. B, Enzymatic 19–20: 489–498.
Nielsen P.M.,D. Petersen and C. Dambmann (2001). Improved method for
determining food protein degree of hydrolysis. Journal of food Science, Vol.
66, No.5, pp. 642-646.
ZHU Xian, ZHU Chao, ZHAO Liang and CHENG Hongbin (2008). Amino Acids Production from Fish Proteins Hydrolysis in Subcritical Water. Chinese Journal of Chemical Engineering, 16(3) 456-460.
Rowan, A.D., Buttle, D.J. and Barrett, A.J (1990). The cysteine proteinases of the pine apple plant. Biochem. J. 266, 869–875.
Soottawat Benjikul and Michael T. Morrissey (1997). Protein Hydrolysates from Pacific Whiting Solid Waste. Oregon State University Seafood Laboratory, 250 36th Street, Astoria, Oregon 97103-2499.
Suthasinee Nilsang, Sittiwat Lertsiri, Manop Suphantharika, Apinya Assavanig (2004). Optimization of enzymatic hydrolysis of fish soluble concentrate by commercial proteases. Journal of food engineering.
Rasa Slizyte, Turid Rustad, Ivar Storro (2005). Enzymatic hydrolysis of cod (Gadus morhua) by-products Optimization of yield and properties of lipid and protein fractions. Process Biochemistry 40: 3680–3692.
Ghaly AE, Ramakrishnan VV, Brooks MS, Budge SM and Dave D (2013).
Fish Processing Wastes as a Potential Source of Proteins, Amino Acids and Oils. Microbial & Biochemical Technology.
Trang web tham khảo:
http://agroviet.gov.vn/ http://voer.edu.vn/
https://blogthuysan.wordpress.com/ http://doc.edu.vn/
PHỤ LỤC B: PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
1.1. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM ẨM
Đối với thực phẩm lỏng, phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ẩm bằng khúc xạ kế. Khúc xạ kế có thể đo đƣợc hàm lƣợng chất khô hòa tan từ đó ta có thể suy ra hàm lƣợng ẩm trong thực phẩm.
Đối với thực phẩm khô thì phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ẩm bằng phƣơng pháp sấy đến trọng lƣợng không đổi. Ban đầu đem khối lƣợng mẫu đi cân sau đó đem đi sấy ở 105 oC đến trọng lƣợng không đổi. Lấy khối lƣợng ban đầu trừ đi khối lƣợng sau khi sấy thì phần khối lƣợng mất đi chính là khối lƣợng nƣớc của thực phẩm. Công thức tính kết quả : m x G G X ( 2 1) 100
Trong đó : G1 : khối lƣợng mẫu và cốc trƣớc khi sấy (g)
