Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong bình tam giác 50 ml. Cân nguyên liệu cơ chất thịt cá theo đúng khối lƣợng đã bố trí vào các bình tam giác. Sau đó cho thêm vào mỗi bình 10 ml dung dịch đệm phosphate 6.5 rồi dùng đũa thủy tinh để làm nhuyễn nguyên liệu ra và đem ủ ở nhiệt độ 550
C trong 30 phút. Rồi cho 0,5 ml enzyme (tƣơng ứng 1,5 mg) đã đƣợc hoạt hóa cùng với dung dịch đệm ở cùng nhiệt độ vào các bình tam giác trên, cho thủy phân trong 30 phút. Sau đó kết thúc quá trình thủy phân bằng 5 ml TCA 5%, rồi ổn định trong 30 phút và lọc để xác định các chỉ tiêu.
Mỗi mẫu đều có mẫu đối chứng là enzyme bị bất hoạt bằng TCA 5%.
3.3.1.4. Chỉ tiêu phân tích:
Hàm lƣợng tyrosine sinh ra sau mỗi phản ứng thủy phân.
3.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định cặp tỉ lệ enzyme/cơ chất (E/S) tối ƣu cho phản ứng thủy phân cho phản ứng thủy phân
3.3.2.1. Mục đích thí nghiệm:
Nhằm xác định đƣợc hàm lƣợng enzyme và cơ chất hiệu quả nhất cho quá trình thủy phân.
3.3.2.2. Bố trí thí nghiệm:
Với hàm lƣợng cơ chất tƣơng ứng với tốc độ phản ứng cực đại Vmax và hàm lƣợng enzyme là 1,5 mg, tăng tuyến tính cặp tỉ lệ này lên với 4 mức độ. Trong đó, E1 và S1 là cặp tỉ lệ ban đầu.
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 2
Cơ chất (g) S1 S2 S3 S4 S5
Lƣợng
enzyme (mg) E1 E2 E3 E4 E5
Thí nghiệm đƣợc lặp 3 lần và tổng số đơn vị thí nghiệm là 12
3.3.2.3. Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm cũng đƣợc thực hiện trong bình tam giác 50 ml. Cân khối lƣợng nguyên liệu tƣơng ứng cho vào các bình tam giác. Thêm vào đó 10 ml dung dịch đệm phosphate 6.5 và dung đũa thủy tinh để làm nhuyễn nguyên liệu rồi ủ ở 550C trong 30 phút. Sau đó cho 0,5 ml enzyme (tƣơng ứng với các nồng độ đã tính trƣớc) đã đƣợc hoạt hóa với dung dịch đệm ở cùng nhiệt độ vào các bình tam giác, rồi cho phản ứng thủy phân trong 30 phút. Bất hoạt enzyme để kết thúc quá trình phản ứng bắng TCA 5%, ổn định dung dịch trong 30 phút sau đó đem lọc để lấy dịch xác định các chỉ tiêu.
Mỗi mẫu đều đƣợc thực hiện tƣơng ứng với các mẫu đối chứng là bất hoạt enzyme bằng dung dịch TCA 5%.
3.3.2.4. Chỉ tiêu phân tích theo dõi:
Hàm lƣợng Tyrosin và hàm lƣợng đạm amine sinh ra trong mỗi phản ứng thủy phân.
3.3.3. Thí nghiệm 3: Xác định thời gian tối ƣu cho phản ứng thủy phân bằng enzyme bromelain trên cơ chất thịt dè cá tra đƣợc tách béo. phân bằng enzyme bromelain trên cơ chất thịt dè cá tra đƣợc tách béo.
3.3.3.1. Mục đích thí nghiệm:
Nhằm các định thời gian thủy phân cho hiệu quả thủy phân tốt nhất cho cặp tỉ lệ E/S tìm đƣợc ở thí nghiệm trên.
3.3.3.2. Bố trí thí nghiệm:
Sau khi xác định đƣợc cặp tỉ lệ E/S thích hợp (thí nghiệm 2), bố trí thí nghiệm một nhân tố (thời gian) với 6 mốc thời gian (30; 60; 90; 120; 180 và 240 phút).
3.3.3.3. Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm cũng đƣợc thủy phân trong bình tam giác 50 ml. Cân khối lƣợng nguyên liệu đã đƣợc định sẳn vào các bình tam giác, cho vào đó 10 ml dung dịch đệm phosphate 6.5 rồi dùng đủa thủy tinh làm nhuyễn ra. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 550
C trong 30 phút rồi cho enzyme đã đƣợc hoạt hóa (trong dung dịch đệm ở cùng nhiệt độ) vào để thủy phân theo các mốc thời gian trên. Sau đó, để kết thúc quá trình thủy phân bằng dung dịch TCA 5%, để yên trong 30 phút rồi đem lọc lấy dịch để xác định các chỉ tiêu.
3.3.3.4. Chỉ tiêu phân tích theo dõi:
Hiệu suất thủy phân, hàm lƣợng tyrosine và hàm lƣợng đạm amine sinh ra sau mỗi phản ứng thủy phân.
Chƣơng IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NGUYÊN LIỆU
Thành phần hóa học của nguyên liệu thịt dè cá tra đã đƣợc tách béo một phần bằng phƣơng pháp cơ học tính theo căn bảng ƣớt đƣợc xác định (AOAC, 1990) trƣớc khi thủy phân đƣợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4.1. Thành phần hóa học của nguyên liệu
Thành phần hóa học Phần trăm (%)
Độ ẩm 70,085
Protein tổng số 20,651
Lipid 3,935
Từ bảng thành phần hóa học của nguyên liệu cho thấy đƣợc hàm lƣợng protein của nguyên liệu là tƣơng đối cao và đây là nguồn nguyên liệu có giá trị dinh dƣỡng cao phù hợp trong chế biến nhiều sản phẩm khác có giá trị hơn.
4.2. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT TỐI ƢU VÀ THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME BROMELAIN TRÊN CƠ CHẤT THỊT DÈ CÁ HỌC CỦA ENZYME BROMELAIN TRÊN CƠ CHẤT THỊT DÈ CÁ TRA ĐÃ ĐƢỢC TÁCH MỘT PHẦN BÉO.
Tốc độ phản ứng của enzyme trong một giới hạn nào đó nó phụ thuộc vào nồng độ cơ chất có trong môi trƣờng. Khi enzyme vẫn chƣa bảo hòa bởi nồng độ cơ chất thì nó vẫn quan hệ tỉ lệ với nồng độ cơ chất, tức là khi nồng độ cơ chất tăng thì tốc độ phản ứng cũng tăng theo và đạt đến cực đại. Nhƣng khi nồng độ cơ chất đã vƣợt quá ngƣỡng phản ứng của nồng độ enzyme (thừa cơ chất), khi đó chính nồng độ cơ chất sẽ làm ngăn cản sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất làm giảm tốc độ phản ứng của enzyme. Do vậy thí nghiệm khảo sát biến thiên vận tốc phản ứng thủy phân của cơ chất thịt dè cá tra đã đƣợc tách béo một phần bằng enzyme bromelain bằng cách thay đổi nồng độ cơ chất trong khoảng từ 0,0207- 1,4455 (gPro/10 ml dd đệm) ở điều kiện nhiệt độ và pH tối ƣu của enzyme bromelain tƣơng ứng là 55oC và 6,5 để tìm khoảng nồng độ cơ chất mà enzyme chƣa bị ức chế bởi nồng độ cơ chất. Đồng thời, phản ứng thủy phân đƣợc cố định với hoạt tính của enzyme bromelain là 4,428 AU (tƣơng đƣơng 1,5 mg).
Thật vậy, kết quả thí nghiệm thu đƣợc thì vận tốc phản ứng thủy phân tăng (0,0701-0,6146 mol Tyr/phút) trong khoảng nồng độ cơ chất 0,0207- 1,1358 (gPro/10 ml dd đệm). Nhƣng sau đó khi nồng độ cơ chất lớn hơn 1,1358 (gPro/10ml dd đệm) thì vận tốc có xu hƣớng giảm xuống. Theo kết quả thống kê, kiểm định LSD về ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hàm lƣợng tyrosine sinh ra (phụ lục C, bảng C.1; C.2 và C.3). Kết quả kiểm định LSD về
nồng độ cơ chất từ 1,1358; 1,2390; 1,3423 và 1,4455 (gPro/10 ml dd đệm) thì vận tốc phản ứng tƣơng ứng là 0,6146; 0,5922; 0,5631 và 0,5344 molTyr/phút. Nhƣ vậy, hàm lƣợng tyrosine sinh ra giảm dần và khác biệt có ý nghĩa thống kê theo sự gia tăng của nồng độ cơ chất trong khoảng từ 1,1358- 1,4455 (gPro/10 ml dd đệm). Hiện tƣợng này có thể đƣợc giải thích khi hàm lƣợng cơ chất cao sẽ gây kiềm hãm hoạt động của enzyme, enzyme kết hợp với nhiều cơ chất tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất không hoạt động (Phạm Thị Trân Châu, 2000).
Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng sau 1,1358 (gPro/10 ml dd đệm) thì tốc độ phản ứng của enzyme bị ức chế bởi nồng độ cơ chất. Thế nên, các thông số động học của enzyme sẽ xác định thông qua phần mềm SAS 9.1.3 portable.exe với nồng độ cơ chất trong khoảng từ 0,0207- 1,1358 (gPro/10ml dd đệm) tƣơng quan với biến thiên của tốc độ phản ứng. Và độ thị Michealis-Menten trên nguyên liệu đƣợc biểu diễn nhƣ sau:
Hình 4.1. Đồ thị thể hiện Vmax và Km của enzyme Bromelain
Kết quả cho thấy, vận tốc phản ứng cực đại của enzyme bromelain trên cơ chất thịt dè đã loại bỏ một phần béo là Vmax= 0,6487 (mol Tyr/phút) và hằng số Michealis Km = 0,0964 (gPro/10ml dd đệm). Theo kết quả nghiên cứu của Tạ Hùng Cƣờng (2014) cho thấy vận tốc phản ứng cực đại của enzyme Bromelain trên cơ chất thịt dè cá tra là Vmax=0,634 (mol/phút). Qua đó, thấy rằng hàm lƣợng chất béo có trong nguyên liệu có thể là tác nhân ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng của enzyme Bromelain trên nguyên liệu thịt dè cá tra.
mol T yr /phút Nồng độ cơ chất (gPro/10ml dd đệm)
4.3. XÁC ĐỊNH CẶP TỈ LỆ E/S HIỆU QUẢ NHẤT CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN THỦY PHÂN
Thông qua kết quả thí nghiệm trên ta thấy rằng, với nồng độ enzyme là 1,5 mg thì có khả năng xúc tác tối đa cho lƣợng cơ chất là 1,1358 gPro. Do vậy, thí nghiệm đƣợc tiến hành bằng cách tăng nồng độ enzyme tuyến tính theo nồng độ cơ chất nhằm tìm đƣợc nồng độ cơ chất tối ƣu mà enzyme có khả năng thủy phân hiệu quả với cùng một giá trị tỉ lệ E/S. Kết quả thí nghiệm với hàm lƣợng tyrosine và đạm amine sinh ra sau quá trình thủy phân nhƣ sau:
Bảng 4.2. Hàm lƣợng tyrosine và đạm amine sau khi thủy phân
STT Hàm lƣợng enzyme (mg) Hàm lƣợng protein (g) Hàm lƣợng Tyrosine (g/100gPro) Hàm lƣợng đạm amine (mg/gNL) 1 1,5 1,1358 0,671d 1,203a 2 1,8 1,3629 0,709e 1,604d 3 2,1 1,5901 0,615c 1,428c 4 2,4 1,8172 0,585b 1,361bc 5 2,7 2,0444 0,515a 1,294ab
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%)
Từ kết quả thí nghiệm đồng thời thông qua kết quả thống kê, kiểm định LSD về sự ảnh hƣởng của tỉ lệ E/S đến hàm lƣợng tyrosine sinh ra (phụ lục C, bảng C.4; C.5; C.6) và hàm lƣợng đạm amine sinh ra (phụ lục C, bảng C.7; C.8; C.9) trong phản ứng thủy phân. Với các mức nồng độ cơ chất 1,1358; 1,3629; 1,5901; 1,8172; 2,0444 (gPro/10 ml dd đệm) thì hàm lƣợng tyrosine sinh ra sau phản ứng thủy phân lần lƣợt là 0,671; 0,709; 0,615; 0,585; 0,515 mg/gPro. Qua đó, so với cặp tỉ lệ E/S ban đầu (1,5 mgE/1,1358 gPro) khi tăng nồng độ enzyme tuyến tính theo nồng độ cơ chất thì hàm lƣợng tyrosine sinh ra tăng lên ở cặp 1,8 mgE/1,3629 gPro. Nhƣng với các cặp tỉ lệ E/S tiếp theo 2,1 mgE/1,5901 gPro; 2,4 mgE/1,8172 gPro và 2,7 mgE/ 2,0444 gPro thì hàm lƣợng tyrosine sinh ra thấp hơn so với cặp tỉ lệ ban đầu. Đồng thời, với các mức cơ chất trên thì hàm lƣợng đạm amine sinh ra sau phản ứng thủy phân lần lƣợt là 1,203; 1,604; 1,428; 1,361 và 1,294 mg/gNL. Qua đó, so với cặp tỉ lệ E/S ban đầu thì hàm lƣợng đạm amine tăng lên ở cặp 1,8 mgE/1,3629 gPro và sau đó lƣợng đạm amine giảm dần. Đặc biệt ở cặp 2,7 mgE/2,0444 gPro thì hàm lƣợng đạm amine không khác biệt ý nghĩa so với cặp tỉ lệ ban đầu. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Tạ Hùng Cƣờng (2014) dù tăng nồng độ enzyme lên nhƣng ở nồng độ cơ chất cao thì hoạt động thủy phân của enzyme cũng không hiệu quả, điều đó cũng cho thấy rằng mặc dù tăng nồng độ enzyme lên nhƣng ứng với nồng độ cơ chất càng cao thì độ linh động của
enzyme càng giảm vì khả năng gắn kết giữa enzyme và cơ chất cũng bị ức chế.
Vậy với chỉ tiêu là hàm lƣợng tyrosine và hàm lƣợng đạm amine sinh ra trong phản ứng thủy phân thì thí nghiệm tăng tuyến tính nồng độ enzyme theo nồng độ cơ chất thì cho hiệu quả tối ƣu ở cặp tỉ lệ 1,8 mgE/1,3629 gPro. Theo kết quả nghiên cứu của Tạ Hùng Cƣờng (2014) khi khảo sát cặp tỉ lệ E/S hiệu quả cho quá trình thủy phân protein trên nguyên liệu thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain cho hiệu quả tối ƣu ở cặp tỉ lệ 2,5 mgE/0,905 gPro. Qua đó cho thấy rằng, với nguyên liệu là thịt dè đã đƣợc tách béo một phần thì enzyme bromelain có khả năng thủy phân với hàm lƣợng cơ chất cao hơn so với nguyên liệu là thịt dè chƣa tách béo.
4.4. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN TỐI ƢU CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN 4.3.1. Xác định hàm lƣợng tyrosine và hàm lƣợng đạm amine sinh 4.3.1. Xác định hàm lƣợng tyrosine và hàm lƣợng đạm amine sinh ra theo thời gian thủy phân
Để tăng hiệu suất và hiệu quả của quá trình thủy phân enzyme trên cơ chất, tiến hành thí nghiệm đối kéo dài thời gian thủy phân đối với cặp tỉ lệ E/S tối ƣu (1,8 mgE/1,3629 gPro). Và kết quả thí nghiệm nhƣ sau:
Bảng 4.3. Hàm lƣợng tyrosine và đạm amine theo thời gian Thời gian thủy phân
(phút) Hàm lƣợng Tyrosine (mg/gPro) Hàm lƣợng đạm amine (mg/gNL) 30 0,736a 1,625a 60 0,959b 2,094b 90 1,026c 2,505c 120 1,077d 2,677d 180 1,126e 2,839e 240 1,161f 3,014f
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%)
Qua bảng số liệu cho thấy, khi tăng thời gian lên thì khả năng thủy phân của enzyme cũng tăng theo. Điều đó đƣợc thể hiện thông qua sự tăng của hàm lƣợng tyrosine và hàm lƣợng đạm amine sinh ra trong quá trình thủy phân, nhƣng chỉ tăng nhanh trong giai đoạn đầu và thời gian thủy phân càng dài về sau thì tăng chậm hơn. Thật vậy, điều này có thể đƣợc giải thích khi thời gian thủy phân càng dài thì hoạt tính thủy phân của enzyme càng giảm, do trong quá trình thủy phân các phân tử protein bị phân cắt thành acid amine và các peptide có trọng lƣợng phân tử thấp hòa tan trong dung dịch, chính những nhân tố này là chất ức chế hoạt tính của enzyme nên thời gian thủy phân càng dài thì hoạt tính của enzyme càng giảm (Nguyễn Xuân Trình và cộng sự., 2013). Ngoài ra, bản thân enzyme là một protein nên có thể tự thủy phân làm cho hoạt tính thủy phân giảm dần theo thời gian (Tạ Hùng Cƣờng, 2014).
Kết quả ở thời gian thủy phân là 240 phút với hàm lƣợng Tyrosine sinh ra tƣơng ứng là 1.161 gTyr/100gPro (tƣơng đƣơng với 0,799 gTyr/100g căn bản khô). Kết quả này có sự khác biệt so với báo cáo của Suthasinee Nilsang
et al., (2004) ở điều kiện thủy phân tối ƣu của enzyme Flavourzyme sau 6 giờ thủy phân cho hàm lƣợng Tyrosine sinh ra ở cơ chất thịt cá và protein thịt cá lần lƣợt là 0,39 và 0,4 gTyr/100g căn bản khô. Và nghiên cứu của Mahmoudreza Ovissipour et al., (2009) về khả năng thủy phân của enzyme alcalase trên nội tạng của cá Tuyết cho hàm lƣợng Tyrosine 0,77 g Tyr/100 gPro. Hơn nữa, một nghiên cứu của Mahmoudreza Ovissipour et al., (2010) cho thấy thành phần Tyrosine của protein thủy phân từ đầu cá Ngừ vây vàng bằng enzyme Alcalase và Protamex tƣơng ứng là 2,54 và 1,67 gTyr/100gPro trong 24 giờ thủy phân. Đồng thời, kết quả này có sự khác biệt so với nghiên cứu của Tạ Hùng Cƣờng (2014) về hàm lƣợng tyrosine sinh ra khi dùng enzyme bromelain thủy phân thịt dè cá tra ở 240 phút là 0,919 gTyr/100gPro.
4.3.2. Tính hiệu suất thủy phân
4.3.2.1. Tính hiệu suất thủy phân theo hàm lượng tyrosine sinh ra
Hàm lƣợng tyrosine tổng đƣợc xác định bằng cách thủy phân hoàn toàn 1gPro bằng acid HCl 6N ở 110oC trong 24 giờ theo phƣơng pháp của ZHU Xian et al., (2008) cho kết quả là 2,3867 gTyr/100g (căn bản khô) (tƣơng đƣơng với 3,4576 gTyr/100gPro). Kết quả thí nghiệm này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Tran Trung Tuan (2010) về phụ phẩm cá tra có hàm lƣợng tyrosine tổng là 2,4 gTyr/100gPro (căn bản khô) và một nghiên cứu khác của Ghaly AE et al., (2013) về hàm lƣợng tyrosine trên phụ phẩm cá nƣớc ngọt cũng cho hàm lƣợng tyrosine tổng là 2,4 gTyr/100g (căn bản khô). Đồng thời cũng phù hợp với một nghiên cứu của Mahmoudreza Ovisspour et al., (2009) thì hàm lƣợng Tyrosine tổng trong nội tạng cá tuyết là 2,34 gTyr/100g (căn bản khô).
Theo kết quả nghiên cứu của Soottawat Benjakul và Micheal T. Morrissey (1997) thì hiệu suất thủy phân của enzyme có thể tính bằng hàm lƣợng amino acid sinh ra khi thủy phân tại một thời điểm bất kỳ trên hàm lƣợng amino acid tổng trong cùng một khối lƣợng cơ chất. Trong quá trình thủy phân thì hoạt tính thủy phân của enzyme đƣợc xác định bằng hàm lƣợng tyrosine sinh ra mà nó là một amino acid. Vì vậy, có thể tính hiệu suất thủy phân dựa vào hàm lƣợng tyrosine do enzyme thủy phân sinh ra trên hàm lƣợng tyrosine tổng trong cùng một đơn vị khối lƣợng. Và kết quả hiệu suất thủy phân tính theo hàm lƣợng Tyrosine đƣợc thể hiện thông qua đồ thị sau:
Hình 4.2. Đồ thị thể hiện hiệu suất thủy phân của enzyme Bromelain theo hàm lƣợng tyrosine.
4.3.2.2. Hiệu suất thủy phân theo phần trăm đạm amine.
Trong quá trình thủy phân cơ thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain thì