Sử dụng phương pháp đĩa kết hợp theo tiêu chuẩn của CLSI (2014) để phát hiện vi khuẩn E. coli ESBL.
Cách tiến hành:
Mẫu swab phân đem về được ria cấy trực tiếp trên môi trường MC có chứa kháng sinh ceftazidime (2mg/l) rồi ủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Chọn 10 khuẩn lạc nghi ngờlà E. coli (to, tròn đều, hơi lồi, màu hồng đậm, mọc rời rạc) cấy thuần trên môi trường NA, ủ ấm 370C trong 24 giờ. Sau đó kiểm tra
đặc tính sinh hóa để khẳng định là E. coli bằng cách cấy vi khuẩn lên các môi
trường Trypton (Indole), MR-VP, Simmons Citrate, ủ ấm 37oC/24 giờ và đọc kết quả.
-Môi trường Trypton dùng đểkiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Nhỏvài giọt thuốc thử Kovac’s vào nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ thì phảnứng dương tính và ngược lại nếu trên bềmặt môi trường không xuất hiện vòngđỏ thì Indole âm tính.
-Môi trường Methyl Red dùng để kiểm tra tính sửdụng đường của vi khuẩn. Nhỏ vàomôi trường vài giọt thuốc thửmethyl red, phảnứng dương tính sẽ có màuđỏxuất hiện trên bềmặt môi trường và ngược lại.
-Môi trường Voges-Proskauer lần lượt nhỏ vài giọt thuốc thử VP1 sau đó vài
giọt thuốc thử VP2, nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton. Ngược lại, nếu trên bềmặt môi trường không xuất hiện vòngđỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton.
- Môi trường thạch nghiêng Simmons Citrate dùng để kiểm tra khả năng sử
dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn. Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính khi màu của môi trường chuyển từxanh lục sang xanh
Bảng 3.1.Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
Môi trường Kết quả
Trypton Dương tính
Methyl Red Dương tính
Voges-Proskauer Âm tính
Simmons Citrate Âm tính
Lấy khuẩn lạc được xác định là E. colidương tính đãđược cấy thuần trên NA, cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí NaCl 0,9% đã được hấp tiệt trùng, lắc đều bằng máy vortex rồi so độ đục với ống Mac Farland 0,5 tương đương có chứa vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml. Chuẩn bị môi trường MHA với
độ dày thạch khoảng 4mm. Dùng tăm bông vô trùng tẩm huyễn dịch ở 108 CFU/ml (đã được lắc đều), rồi ria đều lên khắp mặt thạch MHA. Sau đó đặt các khoanh giấy kháng sinh ceftazidime (Cz), ceftazidime/acid clavulanic (Zc); cefotaxime (Ct), cefotaxime/acid clavulanic (Tc) lên đĩa thạch theo các vị trí như hình 3.1.
Ủ đĩa ở370C/24h và đo đường kính vòng vô khuẩn. Nếu đường kính vòng vô khuẩn đĩa Zc và Tc lần lượt lớn hơn đĩa Cz và Ct ít nhất 5mm thì kết luận vi khuẩn E. coli sinh ESBL và giữgiống vi khuẩn.
Chú thích:
1a: ceftazidime 2a: cefotaxime
C 1a C 2a C Z C 2b
Hình 3.1 Phương pháp đĩa kết hợp phát hiện E. coli ESBL
Mẫu swab
Cấy trên môi trường MC chứa ceftazidime (2mg/l) 370C/24h
Cấy thuần trên môi trường NA
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
Indol (+) MR (+) VP (-) Citrate (-) 370C/24h
Giữgiống Khẳng định E. coli
Pha huyễn dịch vi khuẩn có nồng độ108CFU/ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cấy trên môi trường MHA
Đặt đĩa kháng sinh (Cz, Zc, Ct, Tc)
Đo đường kính vòng vô khuẩn và kết luận E. coli ESBL
Hình 3.2 Quy trình nuôi cấy và phân lập vi khuẩn E. coli ESBL