Đềtài thu thập 48 con gà khỏe mạnh được lấy ngẫu nhiênở các hộ chăn nuôi
tại huyện Mang Thít và huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long, trong đó gà thịt 1 tuần tuổi là 12 con, 1 tháng tuổi là 12 con và gà đẻ là 24 con. Trước khi lấy mẫu, dùng cồn sát trùng xung quanh hậu môn gà, sau đó dùng tăm bông vô
trùng ngoáy vào lỗ huyệt của gà rồi cho vào môi trường vận chuyển Cary Blair.Sau đó, ghi ký hiệu cho từng mẫu và bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển vềphòng thí nghiệm đểphân tích.
3.2.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Sử dụng phương pháp đĩa kết hợp theo tiêu chuẩn của CLSI (2014) để phát hiện vi khuẩn E. coli ESBL.
Cách tiến hành:
Mẫu swab phân đem về được ria cấy trực tiếp trên môi trường MC có chứa kháng sinh ceftazidime (2mg/l) rồi ủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Chọn 10 khuẩn lạc nghi ngờlà E. coli (to, tròn đều, hơi lồi, màu hồng đậm, mọc rời rạc) cấy thuần trên môi trường NA, ủ ấm 370C trong 24 giờ. Sau đó kiểm tra
đặc tính sinh hóa để khẳng định là E. coli bằng cách cấy vi khuẩn lên các môi
trường Trypton (Indole), MR-VP, Simmons Citrate, ủ ấm 37oC/24 giờ và đọc kết quả.
-Môi trường Trypton dùng đểkiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Nhỏvài giọt thuốc thử Kovac’s vào nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ thì phảnứng dương tính và ngược lại nếu trên bềmặt môi trường không xuất hiện vòngđỏ thì Indole âm tính.
-Môi trường Methyl Red dùng để kiểm tra tính sửdụng đường của vi khuẩn. Nhỏ vàomôi trường vài giọt thuốc thửmethyl red, phảnứng dương tính sẽ có màuđỏxuất hiện trên bềmặt môi trường và ngược lại.
-Môi trường Voges-Proskauer lần lượt nhỏ vài giọt thuốc thử VP1 sau đó vài
giọt thuốc thử VP2, nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton. Ngược lại, nếu trên bềmặt môi trường không xuất hiện vòngđỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton.
- Môi trường thạch nghiêng Simmons Citrate dùng để kiểm tra khả năng sử
dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn. Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính khi màu của môi trường chuyển từxanh lục sang xanh
Bảng 3.1.Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
Môi trường Kết quả
Trypton Dương tính
Methyl Red Dương tính
Voges-Proskauer Âm tính
Simmons Citrate Âm tính
Lấy khuẩn lạc được xác định là E. colidương tính đãđược cấy thuần trên NA, cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí NaCl 0,9% đã được hấp tiệt trùng, lắc đều bằng máy vortex rồi so độ đục với ống Mac Farland 0,5 tương đương có chứa vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml. Chuẩn bị môi trường MHA với
độ dày thạch khoảng 4mm. Dùng tăm bông vô trùng tẩm huyễn dịch ở 108 CFU/ml (đã được lắc đều), rồi ria đều lên khắp mặt thạch MHA. Sau đó đặt các khoanh giấy kháng sinh ceftazidime (Cz), ceftazidime/acid clavulanic (Zc); cefotaxime (Ct), cefotaxime/acid clavulanic (Tc) lên đĩa thạch theo các vị trí như hình 3.1.
Ủ đĩa ở370C/24h và đo đường kính vòng vô khuẩn. Nếu đường kính vòng vô khuẩn đĩa Zc và Tc lần lượt lớn hơn đĩa Cz và Ct ít nhất 5mm thì kết luận vi khuẩn E. coli sinh ESBL và giữgiống vi khuẩn.
Chú thích:
1a: ceftazidime 2a: cefotaxime
C 1a C 2a C Z C 2b
Hình 3.1 Phương pháp đĩa kết hợp phát hiện E. coli ESBL
Mẫu swab
Cấy trên môi trường MC chứa ceftazidime (2mg/l) 370C/24h
Cấy thuần trên môi trường NA
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
Indol (+) MR (+) VP (-) Citrate (-) 370C/24h
Giữgiống Khẳng định E. coli
Pha huyễn dịch vi khuẩn có nồng độ108CFU/ml
Cấy trên môi trường MHA
Đặt đĩa kháng sinh (Cz, Zc, Ct, Tc)
Đo đường kính vòng vô khuẩn và kết luận E. coli ESBL
Hình 3.2 Quy trình nuôi cấy và phân lập vi khuẩn E. coli ESBL
3.2.3 Phương pháp kiểm tra tính nhạy cảm của E. coli ESBL đối vớikháng sinh kháng sinh
Kháng sinh đồ(Antimicrobial sensitivity test) là kỹthuật tìm hiểu và đánh giá
mức độmẫn cảm của vi khuẩn E. coli ESBL với các loại kháng sinh. Có nhiều
phương pháp làm kháng sinh đồ, trong đó kỹ thuật khuếch tán trên thạch dựa theo nguyên lý của Kirby-Bauer là kỹthuật phổbiến nhất.
Bảng 3.2. Tiêu chuẩn đường kính vòng kháng khuẩn một số kháng sinh với vi khuẩn họEnterobacteriaceae(CLSI, 2014).
Tên kháng sinh Kí hiệu Lượng kháng sinh (μg) Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Nhạy Trung gian Kháng Ampicillin Am 10 ≥ 17 14 - 16 ≤ 13 Ceftazidime Cz 30 ≥ 21 18 - 20 ≤ 17 Cefuroxime Cu 30 ≥ 18 15 - 17 ≤ 14 Cefotaxime Ct 30 ≥ 26 23 - 25 ≤ 22 Cefaclor Cr 30 ≥ 18 15 - 17 ≤ 14 Gentamicin Ge 10 ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 Streptomycin Sm 10 ≥ 15 12 - 14 ≤ 11 Kanamycin Kn 30 ≥ 18 14 - 17 ≤ 13 Amikacin Ak 30 ≥ 17 15 - 16 ≤ 14 Tetracycline Te 30 ≥ 15 12 - 14 ≤ 11 Doxycycline Dx 30 ≥ 14 11 - 13 ≤ 10 Norfloxacin Nr 10 ≥ 17 13 - 16 ≤ 12 Ofloxacin Of 5 ≥ 16 13 - 15 ≤ 12 Fosfomycin Fo 50 ≥ 16 13 - 15 ≤ 12 Trimethoprim+ sulfamethoxazole Bt 1,25/23,75 ≥ 16 11 - 15 ≤ 10 Cách tiến hành:
Chọn chủng vi khuẩn E. coli ESBL đã phân lập được cho vào 9ml nước muối
Sửdụng kẹp vô trùng để đặt từng khoanh đĩa kháng sinh lên mặt thạch sao cho mặt chữcủađĩa kháng sinh tiếp xúc với mặt thạch, mép ngoài của khoanh giấy cách thành trong của đĩa petri 2cm-2,5cm và 2 đĩa kháng sinh cách nhau 2,5cm-3,5cm. Mỗi đĩa chứa từ 4 đến 5 loại kháng sinh và tất cả 13 loại kháng sinh/vi khuẩn.Đem ủ ở370C trong 16-18 giờrồi đọc kết quả.
Chú ý: Các đĩa kháng sinh bảo quản theo đúng yêu cầu của nhà sản xuất. Không dùng kháng sinh quá hạn, kháng sinhẩm ướt. Khi lấy từtủlạnh ra phải
đểra ngoài 1-2 giờ đểcho nhiệt độtrong lọbằng nhiệt độphòng.
Cách đọc kết quả kháng sinh đồ: Việc đọc kết quả kháng sinh đồ được thực hiện bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước Panme sau đó so
sánh với bảng tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn của kháng sinh theo CLSI (2014).
3.2.4Phương pháp xử lý số liệu
Sốliệu được xửlý bằng phương pháp Chibình phương (Chi –Square test), sử
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả sự hiện diện của vi khuẩnE. coli ESBL trên gà thịt khỏe
Qua tiến hành kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên gà thịt khỏe mạnh ở1 tuần tuổi và 1 tháng tuổi bằng phương pháp đĩa kết hợp cho kết quả ởbảng sau
Bảng 4.1. TỉlệE. coliESBL dương tính trên gà thịt khỏe
Đối tượng Sốmẫu kiểm tra (con) Sốmẫu dương tính (con) Tỉlệ dương tính (%) Gà 1 tuần tuổi 12 5 41,67 Gà 1 tháng tuổi 12 2 16,67 Tổng cộng 24 7 29,17 P = 0,329 Bảng 4.1 cho thấy kết quả phân lập trên 24 mẫu swab phân ở gà thịt khỏe mạnh có tỉ lệ dương tính với E. coli ESBL là 29,17%. Trong đó, gà 1 tuần tuổi có tỉ lệ dương tính với E. coli ESBL cao hơn gà 1 tháng tuổi (41,67% so với 29,17%) và qua kết quảphân tích thống kê cho thấy sựkhác biệt giữa các lứa tuổi này là không có ý nghĩa thống kê (P = 0,329).
Theo Lưu Hữu Mãnh và Đỗ Võ Anh Khoa (2012) nghiên cứu trên giống gà Ross 308ở tỉnh Đồng Nai, tỉ lệnhiễm E. coli trong phân gà bị bệnh tiêu chảy
ở giai đoạn 0-2 tuần tuổi là cao nhất (87%) và có khuynh hướng giảm từ 2-4 tuần tuổi (74%). Điều này cho thấy E. coli là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy trên gà, đặc biệt là gà từ0-2 tuần tuổi. Mặt khác, qua kết quảbảng 4.1 cũng cho thấy gà thịt khỏeở giai đoạn 1 tuần tuổi có tỉlệ
E. coli ESBL dương tính khá cao (41,67%). Qua đó chứng tỏvi khuẩn E. coli
có sẵn trong ruột của gà thịt khỏe mạnh từ khi còn rất nhỏvới tỉ lệ tương đối cao nhưng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề kháng của con vật giảm sút, nếu
người chăn nuôi không đảm bảo điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng hợp lí và
thường xuyên vệsinh môitrường chăn nuôi thì khi dịch bệnh xảy ra sẽrất khó
khăn trong việc sửdụng kháng sinh để điều trị.
Theo Leverstein-van Hall et al. (2011) cho thấy sự lây lan của các vi khuẩn
cho biết trong số các vi khuẩn sinh ESBL phân lập được từ các mẫu thịt gà bán lẻ, có 39% E. coli mang kiểu gen tương tự với kiểu gen phân lập được ở
các mẫu bệnh phẩm trên người. Điều này chứng tỏ sự lan truyền gen kháng thuốc của vi khuẩn sang người có thểthông qua chuỗi thức ăn. Đồng thời, kết quả sự hiện diện E. coli ESBL trên gà thịt khỏe ở bảng 4.1 có tỉ lệ tương đối cao (29,17%), mà gà thịt là một trong những nguồn thực phẩm phổ biến của
con người, vì vậy cần chú ý các khâu vệ sinh trong quy trình giết mổ và an toàn thực phẩm đểtránh vấy nhiễm vi khuẩn một cách trực tiếp hoặc gián tiếp từ gà sang người và ra môi trường xung quanh.
4.2 So sánh tỉ lệE. coliESBL dương tính trên gà thịt và gà đẻ khỏe
Tỉ lệ tạo kiểu hình dương tính với E. coli ESBL trên 2 đối tượng là gà thịt và
gà đẻkhỏe mạnh thểhiệnởbảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quảsự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ khỏe.
Đối tượng Sốmẫu kiểm tra (con) Sốmẫu dương tính (con) Tỉlệ dương tính (%) Gà thịt 24 7 29,17a Gà đẻ 24 14 58,33b Tổng cộng 48 21 43,75 P = 0,042
Các chữa, b trong cùng một cột khác nhau là khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Kết quả bảng 4.2 cho thấy, tỉ lệ hiện diện E. coli ESBL trong tổng số 48 con gà khỏe mạnhđược kiểm tra là tương đối cao (43,75%). Trong đó, gà đẻkhỏe có tỉ lệ E. coli ESBL dương tính là 58,33%, cao hơn so với gà thịt khỏe là 29,17%. Kết quả phân tích thống kê cho thấy có sự khác biệt về tỉ lệ dương
tính với E. coli ESBL giữa 2 đối tượng gà này (P = 0,042). Kết quả này cao
hơn so với kết quả của Duru et al. (2013) nghiên cứu trên phân gà thịt, gà tây và gà thả vườn với tỉ lệ hiện diện E. coli ESBL là 22,2% và nghiên cứu của
Gao et al. (2014) với tỉ lệE. coliESBL trên phân gà là 10,7%. Điều này có thể được giải thích là do gà đẻ có đời sống và thời gian khai thác lâu hơn gà thịt
nên gà đẻ sẽ tiêu thụ một lượng kháng sinh lớn trong thời gian dài, điều này
làm cho E. colicó điều kiện hình thành nên khả năng kháng thuốc nhiều hơn,
cụ thể ở đây là sinh men ESBL. Bên cạnh đó, theo Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền (2012) cho thấy lây nhiễm E. coli từ trứng thì phổ biến và
trọng vệ sinh sát trùng kỹ lưỡng trong quá trình ấp nở trứng để tránh vấy nhiễm vi khuẩn từgà mẹsang con.
4.3 So sánh tỉ lệE. coliESBL dương tính giữa 2 địa điểm lấy mẫu
Tỉ lệ hiện diện E. coli ESBL tại một số nông hộ thuộc huyện Mang Thít và huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long được thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quảsựhiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL tại 2 địa điểm lấy mẫu
Huyện Sốmẫu kiểm tra (con) Sốmẫu dương tính (con) Tỉlệ dương tính (%) Mang Thít 24 14 58,33a Tam Bình 24 7 29,17b Tổng cộng 48 21 43,75 P = 0,042
Các chữa, b trong cùng một cột khác nhau là khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Dựa vào bảng 4.3 cho thấy tỉ lệE. coli ESBL dương tính trên gà thịt và gà đẻ ở huyện Mang Thít là 58,33% cao hơn huyện Tam Bình là 29,17%, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P = 0,042). Theo báo cáo sơ kết công tác chăn
nuôi-thú y 6 tháng đầu năm 2014 của Chi cục Thú y tỉnh Vĩnh Long, huyện
Mang Thít có số lượng tổng đàn gà cao nhất với 1.008.300 concao hơn huyện
Tam Bình với 717.200 con. Bên cạnh đó, theo Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn
Đức Hiền (2012), ở ống tiêu hóa gia cầm có mật độ E. coli khoảng 106CFU/g và lây nhiễm qua phân vẫn là cách lây truyền quan trọng nhất. Vì vậyở những
nơi có quy mô đàn càng lớn thì lượng phân gà bài thải ra môi trường sẽcàng nhiều, đồng thời ở các hộ chăn nuôi quy trình vệ sinh sát trùng chưa được xử
lý chặt chẽ, tạo điều kiện cho vi khuẩn lây truyền rộng rãi trong đàn gà. Điều này cho thấy mặc dù trong cùng một tỉnh Vĩnh Long nhưng ở những huyện khác nhau, với quy mô đàn và điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng, vệ sinh sát trùng khác nhau thì sẽcó thể ảnh hưởng đến sựhiện diện của E. coli ESBL.
4.4 Kết quả kháng sinh đồ
Qua khảo sát 48 mẫu swab phân trên gà khỏe ở một số nông hộ tại huyện Mang Thít và Tam Bình tỉnh Vĩnh Long, có 21 mẫu dương tính với E. coli
ESBL, chọn ra 43 chủng điển hình mang tínhđại diện trong tổng sốchủng E.
coli ESBL phân lập được để tiến hành phân tích tính nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn bằng kỹ thuật khuếch tán trên thạchtheo phương pháp của
Bảng 4.4. Kết quả kháng sinh đồcủa các chủng E. coli ESBL phân lập được Nhóm kháng sinh Sốchủng kiểm tra (n = 43) Nhạy Trung gian Kháng Số lượng Tỉlệ (%) Số lượng Tỉlệ (%) Số lượng Tỉlệ (%) Ampicillin 0 0,00 3 6,98 40 93,02 Cefuroxime 5 11,63 1 2,33 37 86,05 Cefaclor 3 6,98 0 0,00 40 93,02 Gentamycine 17 39,53 2 4,65 24 55,81 Streptomycine 8 18,60 6 13,95 29 67,44 Kanamycin 25 58,14 2 4,65 16 37,21 Amikacin 42 97,67 1 2,33 0 0,00 Tetracyline 32 74,42 10 23,26 1 2,33 Doxycyline 40 93,02 3 6,98 0 0,00 Norfloxacin 16 37,21 5 11,63 22 51,16 Fosfomycin 37 86,05 1 2,33 5 11,63 Ofloxacin 16 37,21 5 11,63 22 51,16 Trimethoprim+ sulfamethoxazole 14 32,56 2 4,65 27 62,79
Dựa vào bảng 4.4 cho thấy trong 13 loại kháng sinh kiểm tra theo tiêu chuẩn của CLSI 2014, E. coli ESBL đềkháng với hầu hết các loại kháng sinh nhóm
β-lactam với tỉ lệ rất cao như ampicillin (93,02%), cefaclor (93,02%) và cefuroxime (86,05%). Đồng thời vi khuẩn cũng đã đề kháng với các kháng
sinh khác nhóm như streptomycine (67,44%) và trimethoprim+ sulfamethoxazole (62,79%). Kết quả này phù hợp với kết quảnghiên cứu của
Duru et al. (2013) cho thấy E. coli ESBL trên gà đã đề kháng với nhiều loại
kháng sinh như cefotaxime, ceftazidime, ampicillin, trimethoprim+
sulphamethoxazole, và các nghiên cứuở Việt Nam vềE. coliESBL trên người cũng đã kết luận vi khuẩn đề kháng với các loại kháng sinh trên. Điều này có thể được giải thích là vì men ESBL sinh ra do đột biến cảm ứng từ việc sử
dụng các cephalosporin phổ rộng thế hệ 3, dẫn đến E. coli sinh ESBL kháng
và mỗi gen xác định tính đề kháng với một loại kháng sinh, vì vậy plasmid có khả năng đềkháng nhiều loại kháng sinh cùng lúc (Trần Đức Hậu, 2007). Bên cạnh đó, kháng sinh tác động vào vi khuẩn phải đi ngang qua màng tế bào vi khuẩn theo cách thức khuếch tán thụ động qua các kênh trên màng. Các loại kháng sinh khác nhau có thể đi qua cùng một kênh, do đó sựbiến đổi của các