2.2.3.1. So với kem bạc sulfadiazin 1%
Nguyên tắc: Tác dụng kháng khuẩn in vitro của sản phẩm bào chế được so sánh với kem bạc sulfadiazin 1% bằng phương pháp khuếch tán từ giấy lọc, đo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch.
Tiến hành:
- Các mẫu thử: dùng panh và patuyn vô trùng tẩm hai mặt các khoanh giấy lọc vô trùng với mẫu thử (mẫu thử dạng thuốc mỡ) một lần sao cho hai mặt khoanh giấy dính đều thuốc như nhau.
- Kháng sinh chuẩn: các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô
được tẩm 3 lần với dung dịch kháng sinh chuẩn; sau mỗi lần tẩm, các khoanh giấy lọc có chứa chuẩn đều được sấy trên nhiệt độ < 60oC đến khô hết dung môi.
- Chuẩn bị môi trường và cấy VSV kiểm định: VSV kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi nuôi cấy cho
phát triển trong tủ ấm 37oC trong thời gian 18-24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Môi trường thạch thường vô trùng (tiệt trùng 118oC/30 phút) được làm lạnh về 45-50oC và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/100 ml. Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch, rồi đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
- Đặt mẫu thử và chứng: khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử (hoặc kháng sinh chứng chuẩn) và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn, số thí nghiệm song song là 3. - Ủ các đĩa Petri có mẫu thử và chứng được đặt như trên trong tủ ấm ở toC = 37oC trong 18-24h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có bằng thước kẹp Panmer với độ chính xác 0,02 mm.
32
2.2.3.2. So với Silvasorb® Gel và gel bạc clorid 0,13%
Nguyên tắc: Tác dụng kháng khuẩn in vitro của sản phẩm bào chế được so sánh với Silvasorb® Gel và gel bạc clorid 0,13% bằng phương pháp khuếch tán từ giếng, đo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch. Thử nghiệm với chủng vi sinh vật Gram âm E. coli ATCC 25922 và chủng vi sinh vật Gram dương
S. aureus ATCC 1128.
Tiến hành:
- Vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang (NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt 0,3%, nước cất vừa đủ 100 ml), rồi ủ cho phát triển trong tủ ấm 37oC trong thời gian 18 giờ đến nồng độ 108 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dẫy dịch chuẩn). Môi trường thạch thường vô trùng (NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt 0,3%, thạch 1,6%, nước cất vừa đủ 100 ml) được tiệt trùng ở 120oC trong 20 phút rồi để nguội kết hợp với làm lạnh về 45-500C và được cấy giống vi khuẩn kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/100 ml. Lắc tròn để vi khuẩn kiểm định phân tán đều trong MT thạch, rồi đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
- Trên bề mặt mỗi đĩa thạch đục 5 giếng thạch cách đều nhau, mỗi giếng có đường kính 6,5 mm, sâu 4 mm.
- Bơm mẫu vào giếng thạch tương ứng, thể tích mẫu 0,09 - 0,11 ml. - Các đĩa thạch có mẫu được đặt trong tủ ấm ở toC = 37oC trong 18-24h rồi lấy ra đọc kết quả. Đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có bằng thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02 mm.
2.2.3.3. Đánh giá kết quả
Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá theo công thức:
D = n D n i i 1 , s = 1 ) ( 1 2 n D n i i D D
33
Di: Đường kính vòng vô khuẩn.
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh. n: Số thí nghiệm làm song song (3)
34
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định một số đặc tính của thuốc mỡ bạc clorid 0,13% 3.1.1. Kích thước và thế Zeta của tiểu phân dược chất
Trong sản phẩm, AgCl tồn tại ở dạng dung dịch. Khi hòa loãng với nước, các tiểu phân AgCl được tạo thành. Các tiểu phân dược chất có đường kính trung bình khoảng 180 nm, phân bố kích thước tương đối đều với giá trị PDI khoảng 0.2. Trong khi đó, các tiểu phân hoạt chất trong Silvasorb® gel có kích thước lớn hơn gần 5 lần với đường kính trung bình khoảng 870 nm, giá trị PDI khoảng 0.37.
Hình 3.1. Kích thước tiểu phân dược chất của thuốc mỡ AgCl 0,13% (a) và
Silvasorb® gel (b)
Các tiểu phân nano AgCl trong thuốc mỡ bạc clorid 0,13% có thế Zeta khoảng -41 mV. Giá trị tuyệt đối của thế Zeta tương đối lớn, kết hợp với chỉ số PDI nhỏ dự báo độ ổn định cao của sản phẩm.
3.1.2. Hình dạng tiểu phân
Ảnh chụp SEM của hỗn dịch cho thấy các tiểu phân dược chất có hình dạng chủ yếu là hình lập phương, kích thước cạnh khoảng 200 nm. Các tiểu phân không được sắc cạnh có thể là do chúng được bao bọc bởi PEG. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
35
Hình 3.2. Hình dạng tiểu phân bạc clorid quan sát bằng kính hiển vi
điện tử quét
3.1.3. Độ nhớt
Kết quả đo độ nhớt của sản phẩm thuốc mỡ bào chế được có giá trị trung bình là 7820 cP.
3.1.4. Hàm lượng hoạt chất
- Xây dựng đường chuẩn định lượng bạc toàn phần
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn bạc trong dung dịch acid nitric 1% tinh khiết AAS có nồng độ biến thiên trong khoảng 0,1 - 4,0 ppm. Tiến hành đo độ hấp thụ theo điều kiện đã lựa chọn mục 2.2.3.4. Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.3.
Bảng 3.1. Độ hấp thụ nguyên tử của các dung dịch bạc chuẩn
STT Nồng độ C (ppm) Độ hấp thụ A (x10-4) 1 0,1 37 2 1 375 3 2 745 4 3 1107 5 4 1460
36
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa cường độ hấp thụ và nồng độ
của bạc
Với điều kiện đã lựa chọn, trong khoảng nồng độ 0,1 - 4,0 ppm có mối tương quan tuyến tính tốt giữa độ hấp thụ với nồng độ bạc có trong mẫu với hệ số tương quan R2 = 0,9998. Phương trình đường chuẩn được xác định là:
A.10-4 = 365,49.C + 7,76
- Xác định hàm lượng dược chất trong thuốc mỡ
Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả định lượng mẫu thuốc mỡ AgCl 0,13%
Mẫu Khối lượng
thử (g) Nồng độ C (µg/ml) Hàm lượng Ag+ (µg/g) Hàm lượng AgCl (%) Thử 1 0,5330 1,0680 1001,8760 102,3945 Thử 2 0,5469 1,0782 985,7378 100,7452 Trung bình 101,5699 Từ bảng 3.2, tính được hàm lượng AgCl trong mẫu thuốc mỡ là 0,1320%; bằng 101,57% so với hàm lượng lý thuyết.
3.1.5. Khả năng giải phóng hoạt chất
Khả năng giải phóng ion Ag+ từ thuốc mỡ bạc clorid 0,13% so với Silvasorb® gel được trình bày ở hình 3.4 và bảng 3.3.
37
Hình 3.4. Lượng ion bạc giải phóng từ thuốc mỡ bạc clorid 0,13% so với
Silvasorb® gel theo thời gian (giờ)
Bảng 3.3. Lượng ion bạc giải phóng từ thuốc mỡ bạc clorid 0,13% so với
Silvasorb® gel theo thời gian
Thời gian AgCl Silvasorb
t (giờ) Q (mg) Xt (%) Q (mg) Xt (%) 0 0,000 0,00 0,000 0,00 6 0,060 14,93 0,079 19,66 24 0,097 24,14 0,152 37,83 48 0,156 38,83 0,210 52,28 72 0,198 49,30 0,254 63,23 168 0,221 55,02 0,287 71,44
Như vậy thuốc mỡ chứa tiểu phân nano bạc clorid bào chế được có khả năng giải phóng ion Ag+ trong 3 ngày, có thể lên đến 7 ngày. Tổng lượng ion Ag+ giải phóng là 0,221 mg (55.02%). So với Silvasorb® Gel, khả năng giải phóng hoạt chất của sản phẩm bào chế được thấp hơn. Tuy nhiên, sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.6. Độ bền với ánh sáng
Kết quả theo dõi cho thấy thuốc mỡ bạc clorid 0,13% không đổi màu khi tiếp xúc với tia UV, bước sóng 254 nm. Kích thước tiểu phân của sản
38
phẩm trước và sau khi chiếu tia UV (hình 3.5) gần như không thay đổi, đường kính trung bình khoảng 176 nm, chỉ số PDI khoảng 0,26.
Hình 3.5. Kích thước tiểu phân của sản phẩm trước khi chiếu UV (trái) và sau
khi chiếu UV (phải)
3.1.7. Độ ổn định theo thời gian
- Thể chất: sản phẩm thuốc mỡ bào chế được có thể chất ổn định, không thay đổi sau 6 tháng.
- Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân của sản phẩm ngay sau bào chế và sau 6 tháng được thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Kích thước tiểu phân của sản phẩm sau khi bào chế (a) và sau 6
tháng (b)
Như vậy, sau 6 tháng, kích thước tiểu phân dược chất gần như không thay đổi, đường kính trung bình của các mẫu khoảng 171 nm, chỉ số PDI khoảng 0,2.
39
3.2. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của thuốc mỡ bạc clorid
3.2.1. So với kem bạc sulfadiazin 1%
Tác dụng kháng khuẩn in vitro của thuốc mỡ bạc clorid so với kem bạc sulfadiazin 1% trên 5 chủng vi sinh vật Gram (+) được thể hiện trong hình 3.7 và bảng 3.4.
Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của thuốc mỡ bạc clorid (TM) so với kem
bạc sulfadiazin 1% (SS) và mẫu trắng (MT) trên 1 số vi khuẩn Gram dương: (a) S. aureus, (b) B. subtilis, (c) B. cereus, (d) B. pumilus, (e) S. lutea.
40
Bảng 3.4: Vòng vô khuẩn của thuốc mỡ bạc clorid (TM), kem bạc sulfadiazin
1% (SS) và mẫu trắng (MT) trên 1 số vi khuẩn Gram dương
STT Ký hiệu
S. aureus B. subtilis B. cereus B. pumilus S. lutea
D (mm) S D (mm) S D (mm) S D (mm) S D (mm) S 1 TM 0,07% 10,13 0,15 12,30 0,87 10,67 1,00 10,03 1,00 11,65 1,01 2 TM 0,1% 10,44 0,10 10,89 0,35 10,37 0,50 10,20 0,60 12,00 0,62 3 TM 0,13% 10, 80 0,35 10,81 0,60 10,96 0,44 10,11 0,89 12,47 0,40 4 MT 0 0 8,33 0,12 0 0 0 0 0 5 SS 9,48 0,38 9,25 0,06 8,87 0,42 9,51 0,94 10,31 0,10 6 KSC-P 25,64 0,92 15,91 0,71 17,50 0,98 0 0 0 0
Tác dụng kháng khuẩn in vitro của thuốc mỡ bạc clorid so với kem bạc sulfadiazin 1% trên 4 chủng vi sinh vật Gram (-) được thể hiện trong hình 3.8 và bảng 3.5.
Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của thuốc mỡ bạc clorid (TM) so với kem
bạc sulfadiazin 1% (SS) và mẫu trắng (MT) trên 1 số vi khuẩn Gram âm: (f) E. coli, (g)P. mirabilis, (h) S. flexneri, (i) S. typhimurium.
41
Bảng 3.5. Vòng vô khuẩn của thuốc mỡ bạc clorid (TM), kem bạc sulfadiazin
1% (SS) và mẫu trắng (MT) trên 1 số vi khuẩn Gram âm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Ký hiệu
E. coli P. mirabilis S. flexneri S. typhimurium
D (mm) S D (mm) S D (mm) S D (mm) S 1 TM 0,07% 10,17 0,15 11,19 0,34 10,58 0,33 10,13 0,55 2 TM 0,1% 9,76 0,36 11,57 0,95 10,79 0,53 9,00 0,95 3 TM 0,13% 9,70 0,36 11,08 0,39 10,52 0,34 9,11 0,55 4 MT 0 0 0 0 0 0 0 0 5 SS 8,01 0,01 9,05 0,20 8,91 0,25 8,07 0,63 6 KSC-S 9,03 0,39 16,01 0,67 14,58 0,62 13,87 1,00
Từ các kết quả thu được, có thể thấy thuốc mỡ bạc clorid có tác dụng tốt hơn hẳn kem bạc sulfadiazin 1% ở tất cả các nồng độ khảo sát (0,07%; 0,1% và 0,13%) trên tất cả 9 chủng vi sinh vật thử nghiệm. Các mẫu trắng gần như không có hoạt tính.
3.4.2. So với Silvasorb® Gel và gel bạc clorid 0,13%
Tác dụng kháng khuẩn in vitro của thuốc mỡ AgCl 0,13% so với gel AgCl 0,13% và Silvasorb® gel trên vi khuẩn Gram âm E. coli và vi khuẩn Gram dương S. aureusđược trình bày trong hình 3.9 và bảng 3.6.
Hình 3.9. Tác dụng kháng khuẩn in vitro của thuốc mỡ bạc clorid 0,13% trên S. aureus (trái) và E. coli (phải) so với gel
42
Bảng 3.6. Đường kính vòng vô khuẩn của thuốc mỡ bạc clorid 0,13% trên S. aureus và E. coli so với dạng gel bạc clorid 0,13% và Silvasorb® Gel
STT Mẫu S. aureus E. coli
(mm) S (mm) S 1 Gel AgCl 10,69 0,24 11,15 0,27 2 Mẫu trắng gel 0,00 0,00 0,00 0,00 3 TM AgCl 10,37 0,14 11,41 0,16 4 Mẫu trắng TM 0,00 0,00 0,00 0,00 5 Silvasorb® Gel 33,50 0,53 10,52 0,11
Từ bảng 3.6, có thể thấy thuốc mỡ bạc clorid 0,13% có tác dụng kháng khuẩn trên cả vi khuẩn S. aureus và E. coli. Sản phẩm thuốc mỡ bào chế được có tác dụng trên S. aureus yếu hơn so với Silvasorb® Gel nhưng tác dụng trên
E. coli lại mạnh hơn đáng kể. Tác dụng kháng khuẩn của thuốc mỡ và gel nano bạc clorid gần như tương đương trên hai chủng vi sinh vật khảo sát. Các mẫu trắng không có hoạt tính.
3.3. Bàn luận
- Công thức của thuốc mỡ bạc clorid: Khác với một số tá dược thân nước khác, các tá dược PEG bền vững, có thể bảo quản lâu, không bị thủy phân, oxy hóa, ôi khét. Bản thân các PEG cũng có tác dụng sát khuẩn vì vậy ít bị vi khuẩn và nấm mốc làm hỏng. Hơn nữa, hoạt chất bạc clorid có tác dụng sát khuẩn nên không cần bổ sung thêm chất bảo quản trong công thức. Ngoài ra, tá dược PEG có tính háo ẩm mạnh, để tránh kích ứng vết thương hở nên trong quá trình bào chế thuốc mỡ bạc clorid đã phối hợp thêm nước cất. Sau 6 tháng, thể chất của sản phẩm không đổi nên có thê không cần thêm các tá dược giữ ẩm. Tuy nhiên, một số tạp chất có trong PEG, nhất là các ion kim loại đa hóa trị có thể làm tăng quá trình oxy hóa khử AgCl thành Ag0, có thể ảnh hưởng tới tác dụng của dược chất. Do đó, cần sử dụng các PEG có chất lượng tốt, độ tinh khiết cao.
43
- Công nghệ, kỹ thuật bào chế: nghiên cứu đã giải quyết được vấn đề về độ bền với ánh sáng của bạc clorid bằng công nghệ nano in situ.Các hoạt chất trong sản phẩm tồn tại ở dạng dung dịch. Quá trình tạo phức được đề nghị như sau :
AgCl(s) ⇌ Ag+(aq) + Cl−(aq) Ksp = 77×10−10 Ag+(aq) + 2Cl− ⇌ [AgCl2]− Kf = 1.1×105
→ AgCl(s) + Cl− ⇌ [AgCl2]− K = Ksp × Kf = 1.9×10−5 Chỉ khi hòa loãng với nước hoặc tiếp xúc với vết thương, các tiểu phân nano bạc clorid mới được tạo thành. Điều này giúp cho sản phẩm bền với ánh sáng.
44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Như vậy, thuốc mỡ nano bạc clorid 0,13% đã được bào chế thành công nhờ công nghệ nano in situ. Các tiểu phân nano AgCl chủ yếu có dạng lập phương, đường kính trung bình khoảng 180 nm, phân bố kích thước tương đối đồng đều. Các đặc tính khác của tiểu phân như thế Zeta, hàm lượng dược chất, độ bền với ánh sáng, độ ổn định theo thời gian cũng được xác định. Sản phẩm bào chế được có khả năng giải phóng ion Ag+ trong vòng 3 ngày, có thể lên đến 7 ngày.
Thuốc mỡ thân nước AgCl 0,13% cho tác dụng tốt hơn hẳn kem bạc sulfadiazin 1% trên tất cả các chủng vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) thử nghiệm. So với Silvasorb® Gel, thuốc mỡ bạc clorid 0,13% tuy có tác dụng trên S. aureus yếu hơn nhưng tác dụng trên E. coli lại mạnh hơn đáng kể.
Thuốc mỡ nano bạc clorid 0,13% là thuốc kháng khuẩn đầu tiên trong nước được phát triển từ muối ít tan của bạc. Phát triển nghiên cứu góp phần nâng cao năng lực sản xuất thuốc công nghệ mới trong nước, nhờ đó làm hạ giá thành sản phẩm, giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân. Nhờ thời gian tác dụng kéo dài, sản phẩm bào chế được cũng hứa hẹn khả năng giảm số lần dùng thuốc, thay băng cho bệnh nhân, giúp giảm công việc cho cán bộ y tế.
Về lâu dài, độc tính của sản phẩm trên tế bào lành, tác dụng in vivo trên vết thương, vết bỏng cần được khảo sát, đánh giá. Bên cạnh đó, độ ổn định của sản phẩm trong thời gian dài hơn cũng cần được theo dõi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Thanh Bình, Vũ Đức Lợi, Bùi Thanh Tùng, Nguyễn Thanh Hải (2016), “Nghiên cứu điều chế tiểu phân nano chứa bạc để ứng dụng trong dược phẩm”, Tạp chí khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội – Chuyên san Khoa học Y Dược, 2.
2. Bộ môn bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2013), Kỹ thuật nano và liposome ứng dụng trong Dược phẩm – Mỹ phẩm, 9-52.
3. Bộ môn bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2006), Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc tập 2, NXB Y học, 43-101.
4. Bộ Y tế (1994 & 2002), Dược điển Việt Nam I, II, III, NXB Y học, 1971. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5. Bộ Y tế (2014), Hóa dược tập 2, NXB Y học, 80.
6. Trần Thị Ngọc Dung, Nguyễn Hoài Châu, Đào Trọng Hiền, Nguyễn