2.1.1. Nguyên vật liệu
Bào chế thuốc mỡ bạc clorid:
Thuốc mỡ bạc clorid được bao chế từ những nguyên liệu sau:
Bảng 2.1. Nguyên liệu bào chế thuốc mỡ bạc clorid
STT Nguyên liệu Xuất xứ Tiêu chuẩn
1 Bạc nitrat Trung Quốc DĐVN IV
2 Natri clorid Đức DĐVN IV
3 Polyethylen glycol 600 Đức USP 24
4 Polyethylen glycol 4000 Đức USP 24
5 Natri nitrat Đức DĐVN IV
6 Nước cất Việt Nam DĐVN IV
Đánh giá tác dụng kháng khuẩn:
Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của thuốc mỡ bạc clorid sử dụng:
- Giống VSV kiểm định: Do bộ môn Vi sinh – Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
+ Vi khuẩn Gram (+):
Bacillus cereus ATCC 9946 (B. cereus)
Bacillus pumilus ATCC 6633 (B. pumillus)
Bacillus subtilis ATCC 10241 (B. subtilis)
Sarcina lutea ATCC 9341 (S. lutea)
Staphyllococcus aureus ATCC 6538 và ATCC 1128 (S. aureus)
+ Vi khuẩn Gram (-):
25
Salmonella typhimurium ATCC 13311 (S. typ)
Shigella flexneri DT 112 (S. flexneri)
Proteus mirabilis BV 108 (P. mirabilis)
- Môi trường thử nghiệm :
+ Môi trường canh thanh nuôi cấy VK kiểm định:
NaCl 0,5% ; Pepton 0,5% ; cao thịt 0,3% ; nước vừa đủ 100 ml. + Môi trường thạch thường:
NaCl 0,5% ; Pepton 0,5% ; cao thịt 0,3% ; thạch 1,6% ; nước vừa đủ 100 ml.
- Mẫu kháng sinh chứng:
+ Benzathin penicillin: 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gr(+) (KSC-P). + Streptomycin : 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gr(-) (KSC-S). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chế phẩm so sánh:
+ Kem bạc sulfadiazin 1% (Satyam Pharmaceutical & Chemical PVT.LTD - Ấn Độ, số lô: T14066).
+ Silvasorb® Gel (thuốc điều trị nhiễm trùng ngoài da chứa 0,13% bạc clorid, AcryMed, số lô: 16024102).
+ Gel bạc clorid 0,13% (do một học viên cao học tại Đại học Dược Hà Nội bào chế với sự hướng dẫn của PGS.TS.Phạm Thị Minh Huệ - Đại học Dược Hà Nội và TS.Nguyễn Thị Thanh Bình - Khoa Y Dược, ĐHQGHN).
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
- Máy khuấy từ IKA-WERKE - Máy ly tâm lạnh Biocen 22R
- Máy đo kích thước tiểu phân HORIBA Nano Partica SZ-100 - Máy đo độ nhớt MRC VIS-8
- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS Thermo iCE™ 3300 - Kính hiển vi điện tử quét phân giải cao HITACHI S-4800
26
- Đèn soi sắc kí bản mỏng WFH – 203B
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Bào chế thuốc mỡ bạc clorid 0,13%
Thuốc mỡ thân nước bạc clorid 0,13% được bào chế theo quy trình sau: Hòa tan hoàn toàn dung dịch chứa 30 mmol natri clorid vào 100g PEG 600. Nhỏ từ từ dung dịch chứa 1,47 mmol bạc nitrat vào dung dịch trên, tốc độ nhỏ 0,5 ml/phút, vừa nhỏ vừa khuấy trộn ở tốc độ 500 vòng/phút. Sau đó, thêm 40g PEG 4000 vào rồi đun nóng hỗn hợp đến 60±5oC, khuấy trộn nhẹ ở tốc độ 360 vòng/phút cho đến khi PEG 4000 tan chảy hoàn toàn, thu được dung dịch trong suốt, đồng nhất. Cách ly hỗn hợp khỏi nguồn nhiệt, tiếp tục khuấy trộn đến khi hỗn hợp nguội về nhiệt độ phòng thu được thuốc mỡ bạc clorid 0,13% màu trắng đục, thể chất mềm, mịn. Đóng gói sản phẩm trong lọ nhựa kín. Dán nhãn, bảo quản ở điều kiện thường, tránh ánh sáng trực tiếp.
100g PEG 600
dd natri clorid (30mmol) Khuấy đều (500 vòng/phút) dd NaCl/PEG 600
dd bạc nitrat (1,47 mmol) Nhỏ từ từ từng giọt
Khuấy đều (500 vòng/phút) dd AgCl/PEG 600 Trộn đều 40g PEG 4000 Đun nóng (60±5oC) Khuấy đều (360 vòng/phút) dd AgCl/PEG 600 + PEG 4000 Để nguội về nhiệt độ phòng Khuấy đều (360 vòng/phút) Thuốc mỡ AgCl 0,13%
27
2.2.2. Xác định một số đặc tính của thuốc mỡ bạc clorid 2.2.2.1. Kích thước tiểu phân 2.2.2.1. Kích thước tiểu phân
Hòa loãng thuốc mỡ bạc clorid trong một lượng nước cất thích hợp. Tiểu phân AgCl kết tủa được đo kích thước bằng phương pháp tán xạ laser. Khi chiếu chùm tia laser vào các tiểu phân có kích thước khác nhau sẽ thu được mức tán xạ khác nhau. Dựa vào mức độ tán xạ của chùm tia sau khi va chạm vào tiểu phân, ta có thể tính được kích thước tiểu phân theo thuyết Mie. Sử dụng máy đo kích thước tiểu phân và thế Zeta HORIBA Nano Partica SZ- 100 với các thông số sau:
- Nhiệt độ mẫu đo: 25oC
- Chỉ số khúc xạ môi trường phân tán: 1,330 - Độ nhớt môi trường phân tán: 0,8872 - Chỉ số khúc xạ của tiểu phân: 0,14
2.2.2.2. Thế Zeta
Thế Zeta của sản phẩm được xác định gián tiếp thông qua linh độ điện di khi đặt trong điện trường. Tốc độ tiểu phân được xác định thông qua việc so sánh sự sai khác về pha giữa ánh sáng tán xạ (tia thử) và ánh sáng từ nguồn laze (tia chuẩn) nhờ ứng dụng Doppler. Sử dụng máy đo kích thước tiểu phân và thế Zeta HORIBA Nano Partica SZ-100 với các thông số tương tự như ở mục 2.2.2.1.
2.2.2.3. Hình dạng tiểu phân
- Nguyên tắc: Chùm điện tử quét trên toàn bộ bề mặt của mẫu được thu
lại bởi các đầu dò để biến đổi thành những tín hiệu phản ảnh bề mặt, thành phần của mẫu đưa ra màn hình quan sát. Do cách tạo ảnh, các ảnh SEM có đặc điểm của ảnh 3 chiều.
- Tiến hành: Lấy khoảng 0,1 g mẫu thuốc mỡ bạc clorid cho vào ống
Eppendorf dung tích 1,5 ml và thêm 1 ml nước cất rồi hòa tan. Lấy tổng cộng 12 ống. Ly tâm 12 ống này bằng máy ly tâm lạnh Biocen 22R với tốc độ 16000 vòng/phút, ở nhiệt độ 5°C trong vòng 10 phút để loại bỏ hết tá dược. Sau đó, hút hết phần nước trong mỗi ống, phối hợp phần tủa trong các ống lại
28 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
với nhau. Phân tích hình ảnh tiểu phân bạc clorid bằng kính hiển vi điện tử quét phân giải cao HITACHI S-4800.
2.2.2.4. Độ nhớt
Độ nhớt của thuốc mỡ được xác định bằng máy đo độ nhớt MRC VIS-8, sử dụng kim số 4, tốc độ 0,3 vòng/phút, nhiệt độ 25oC.
2.2.2.5. Hàm lượng hoạt chất
Hàm lượng bạc toàn phần trong sản phẩm được định lượng bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử, kĩ thuật ngọn lửa. Sử dụng máy đo độ hấp thụ nguyên tử AAS Thermo iCE™ 3500 với các điều kiện:
- Dung dịch pha mẫu acid nitric 1% - Đèn cathod rỗng Ag
- Cường độ đèn: 9 mA - Bước sóng: 328,1
- Loại ngọn lửa: Acetylen – không khí nén - Tốc độ khí acetylen: 2,2 l/phút
- Áp suất khí nén: 160 Kpa - Độ cao Burner: 7,5 mm
Tiến hành:
- Trước khi tiến hành pha dung dịch chuẩn và các dung dịch thử, cho dung dịch acid nitric 10% tinh khiết AAS vào các bình sẽ pha mẫu chuẩn và mẫu thử, lắc sau đó ngâm 30 phút, sau đó tráng lại bằng nước trao đổi ion 3 lần (phải sấy khô bình trước khi cân).
- Mẫu chuẩn: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch bạc chuẩn 1000 ppm (HC 095311, Merck) vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất vừa đủ 100 ml, lắc đều, thu được dung dịch có nồng độ bạc là 10 ppm. Lần lượt hút chính xác 2; 3; 5; 6; 10 ml dung dịch này cho vào các bình định mức 100 ml khác nhau. Cho 10 ml dung dịch acid nitric 10% tinh khiết AAS vào mỗi bình, thêm nước cất vừa đủ 100 ml, lắc đều, thu được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ bạc là 0,2 ppm; 0,3 ppm; 0,5ppm; 0,6 ppm; 1,0 ppm.
- Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,5000 g mẫu thuốc mỡ bạc clorid cho vào bình định mức 50 ml. Thêm vào mỗi bình 5 ml HNO3 10% và 5 ml
29
dung dịch NH3. Đun cách thủy cho tan hoàn toàn, để nguội, thêm nước cất vừa đủ 50 ml. Lọc, thu được dung dịch A. Hút 5,0 ml dung dịch A cho vào bình định mức 50 ml, thêm 5 ml dung dịch HNO3 10%, thêm nước cất vừa đủ 50 ml.
- Mẫu trắng: Cho 10 ml dung dịch HNO3 10% vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất vừa đủ 100 ml.
Đánh giá kết quả:
- Hàm lượng phần trăm (kl/kl) bạc toàn phần trong chế phẩm (HLAg) được tính theo công thức:
Trong đó: CAg: nồng độ bạc trong dung dịch đo mt: khối lượng chế phẩm cân thực tế
- Hàm lượng phần trăm (kl/kl) bạc clorid trong chế phẩm (HLAgCl):
2.2.2.6. Khả năng giải phóng hoạt chất
Khả năng giải phóng hoạt chất từ thuốc mỡ bạc clorid được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán qua màng thẩm tích. Sử dụng màng thẩm tích dạng ống Spectral/Por® 4 MWCO 12000-14000 daltons. Tiến hành như sau:
- Chuẩn bị 1 cốc có mỏ đựng 500 ml nước cất. Cân 0,5g thuốc mỡ cho vào màng thẩm tích. Kẹp hai đầu túi. Treo túi trên miệng cốc có mỏ sao cho 2 đầu túi cao hơn mực nước trong cốc; phần thân túi chứa sản phẩm ngập hoàn toàn trong nước. Khuấy 500 vòng/phút bằng thanh khuấy từ.
- Sau 6 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 168 giờ hút 10 ml dịch trong cốc ra đem đi định lượng Ag toàn phần bằng phương pháp AAS như mô tả trong mục 2.3.3.5. Bổ sung lại 10 ml nước cất vào cốc sau mỗi lần lấy mẫu.
Lượng ion bạc Qn (mg) được giải phóng tại thời điểm tn được tính bằng công thức: 87 , 107 32 , 143 Ag HL AgCl HL
30
Trong đó: V (l): thể tích dung dịch nhận v (l): thể tích lấy mẫu
Cn (mg/l): nồng độ dung dịch nhận tại thời điểm tn
Ci (mg/l): nồng độ dung dịch nhận tại thời điểm lấy mẫu ti.
Từ kết quả thu được vẽ biểu đồ lượng ion Ag+ (mg) được giải phóng theo thời gian (giờ). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tỷ lệ % AgCl đã giải phóng từ màng thẩm tích tại thời gian t được xác định theo công thức: 100 n t n Q X m Trong đó:
Xt: Tỷ lệ AgCl giải phóng theo thời gian t (%)
Qn: Tổng lượng AgCl giải phóng tại thời gian lấy mẫu thử (mg) mn: Khối lượng AgCl có trong màng đem thử
2.2.2.7. Độ bền với ánh sáng
Cân khoảng 0,5 g thuốc mỡ bạc clorid rồi trải đều trên đĩa Petri theo hình vuông, cạnh 2 cm. Sử dụng đèn soi sắc kí bản mỏng WFH – 203B để chiếu tia UV 254 nm vuông góc với mặt đĩa trong vòng 6 giờ. Quan sát bằng mắt thường để so sánh sự thay đổi về màu sắc, thể chất và so sánh kích thước tiểu phân dược chất của sản phẩm trước và sau khi chiếu UV bằng phương pháp tương tự như ở mục 2.2.2.1.
2.2.2.8. Độ ổn định theo thời gian
Thuốc mỡ bạc clorid được bảo quản ở điều kiện thường, tránh ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp. Theo dõi sự thay đổi của kích thước tiểu phân của sản phẩm sau những khoảng thời gian nhất định. Kích thước tiểu phân được đo bằng phương pháp tương tự như ở mục 2.2.2.1.
31
2.2.3. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của thuốc mỡ bạc clorid
2.2.3.1. So với kem bạc sulfadiazin 1%
Nguyên tắc: Tác dụng kháng khuẩn in vitro của sản phẩm bào chế được so sánh với kem bạc sulfadiazin 1% bằng phương pháp khuếch tán từ giấy lọc, đo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch.
Tiến hành:
- Các mẫu thử: dùng panh và patuyn vô trùng tẩm hai mặt các khoanh giấy lọc vô trùng với mẫu thử (mẫu thử dạng thuốc mỡ) một lần sao cho hai mặt khoanh giấy dính đều thuốc như nhau.
- Kháng sinh chuẩn: các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô
được tẩm 3 lần với dung dịch kháng sinh chuẩn; sau mỗi lần tẩm, các khoanh giấy lọc có chứa chuẩn đều được sấy trên nhiệt độ < 60oC đến khô hết dung môi.
- Chuẩn bị môi trường và cấy VSV kiểm định: VSV kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi nuôi cấy cho
phát triển trong tủ ấm 37oC trong thời gian 18-24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Môi trường thạch thường vô trùng (tiệt trùng 118oC/30 phút) được làm lạnh về 45-50oC và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/100 ml. Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch, rồi đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
- Đặt mẫu thử và chứng: khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử (hoặc kháng sinh chứng chuẩn) và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn, số thí nghiệm song song là 3. - Ủ các đĩa Petri có mẫu thử và chứng được đặt như trên trong tủ ấm ở toC = 37oC trong 18-24h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có bằng thước kẹp Panmer với độ chính xác 0,02 mm.
32
2.2.3.2. So với Silvasorb® Gel và gel bạc clorid 0,13%
Nguyên tắc: Tác dụng kháng khuẩn in vitro của sản phẩm bào chế được so sánh với Silvasorb® Gel và gel bạc clorid 0,13% bằng phương pháp khuếch tán từ giếng, đo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch. Thử nghiệm với chủng vi sinh vật Gram âm E. coli ATCC 25922 và chủng vi sinh vật Gram dương
S. aureus ATCC 1128.
Tiến hành:
- Vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang (NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt 0,3%, nước cất vừa đủ 100 ml), rồi ủ cho phát triển trong tủ ấm 37oC trong thời gian 18 giờ đến nồng độ 108 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dẫy dịch chuẩn). Môi trường thạch thường vô trùng (NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt 0,3%, thạch 1,6%, nước cất vừa đủ 100 ml) được tiệt trùng ở 120oC trong 20 phút rồi để nguội kết hợp với làm lạnh về 45-500C và được cấy giống vi khuẩn kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/100 ml. Lắc tròn để vi khuẩn kiểm định phân tán đều trong MT thạch, rồi đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
- Trên bề mặt mỗi đĩa thạch đục 5 giếng thạch cách đều nhau, mỗi giếng có đường kính 6,5 mm, sâu 4 mm.
- Bơm mẫu vào giếng thạch tương ứng, thể tích mẫu 0,09 - 0,11 ml. - Các đĩa thạch có mẫu được đặt trong tủ ấm ở toC = 37oC trong 18-24h rồi lấy ra đọc kết quả. Đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có bằng thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02 mm.
2.2.3.3. Đánh giá kết quả
Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá theo công thức:
D = n D n i i 1 , s = 1 ) ( 1 2 n D n i i D D
33 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Di: Đường kính vòng vô khuẩn.
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh. n: Số thí nghiệm làm song song (3)
34
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định một số đặc tính của thuốc mỡ bạc clorid 0,13% 3.1.1. Kích thước và thế Zeta của tiểu phân dược chất
Trong sản phẩm, AgCl tồn tại ở dạng dung dịch. Khi hòa loãng với nước, các tiểu phân AgCl được tạo thành. Các tiểu phân dược chất có đường kính trung bình khoảng 180 nm, phân bố kích thước tương đối đều với giá trị PDI khoảng 0.2. Trong khi đó, các tiểu phân hoạt chất trong Silvasorb® gel có kích thước lớn hơn gần 5 lần với đường kính trung bình khoảng 870 nm, giá trị PDI khoảng 0.37.
Hình 3.1. Kích thước tiểu phân dược chất của thuốc mỡ AgCl 0,13% (a) và
Silvasorb® gel (b)
Các tiểu phân nano AgCl trong thuốc mỡ bạc clorid 0,13% có thế Zeta khoảng -41 mV. Giá trị tuyệt đối của thế Zeta tương đối lớn, kết hợp với chỉ số PDI nhỏ dự báo độ ổn định cao của sản phẩm.
3.1.2. Hình dạng tiểu phân
Ảnh chụp SEM của hỗn dịch cho thấy các tiểu phân dược chất có hình dạng chủ yếu là hình lập phương, kích thước cạnh khoảng 200 nm. Các tiểu phân không được sắc cạnh có thể là do chúng được bao bọc bởi PEG.
35
Hình 3.2. Hình dạng tiểu phân bạc clorid quan sát bằng kính hiển vi
điện tử quét
3.1.3. Độ nhớt
Kết quả đo độ nhớt của sản phẩm thuốc mỡ bào chế được có giá trị trung bình là 7820 cP.
3.1.4. Hàm lượng hoạt chất
- Xây dựng đường chuẩn định lượng bạc toàn phần
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn bạc trong dung dịch acid nitric 1%