2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học a. Phƣơng pháp xử lý và chiết xuất
Tiến hành chiết xuất cryptotanshinon theo nguyên tắc chung về chiết xuất dẫn xuất phenanthraquinon. Lựa chọn quy trình chiết xuất được thực hiện như sau:
- Phương pháp chiết: đun hồi lưu cách thủy. - Dung môi chiết xuất: ethanol 80%.
- Số lần chiết: 3 lần.
21
b. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế
Tiến hành phân lập bằng các kỹ thuật sắc ký cột - Cột nhồi silica gel, hệ dung môi hexan – EtOAc.
- Sắc ký cột pha đảo C18, hệ dung môi pha động là MeOH-H2O.
c. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học
Trên cơ sở các số liệu đã được công bố trong tài liệu tham khảo, hợp chất được xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý gồm:
- Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân NMR. - Phương pháp phổ khối ESI-MS.
2.2.2. Xây dựng phƣơng pháp HPLC
Sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo dược điển Trung Quốc năm 2010 [8].
a. Lựa chọn điều kiện sắc ký
Dùng phương pháp HPLC pha đảo để tách, định tính, định lượng cryptotanshinon trong trong rễ cây đan sâm. Cụ thể, khảo sát điều kiện sắc ký như sau: - Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo.
- Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau.
- Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV, FLD, DAD để đảm bảo vừa phát hiện được được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất.
b. Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích cryptotanshinon theo chương trình khảo sát trên.
22
c. Tính thích hợp hệ thống
Tiêm 6 lần dung dịch cryptotanshinon nồng độ 500 µg/ml vào hệ thống HPLC và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.
d. Tính tuyến tính và khoảng nồng độ
Chuẩn bị một dãy dung dịch cryptotanshinon pha trong MeOH có nồng độ 1 – 200 µg/ml. Tiến hành phân tích các mẫu, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r.
e. Độ chính xác
Độ chính xác (accuracy) của phương pháp được đánh giá bằng độ đúng và độ lặp lại: + Độ đúng (trueness) là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết. Độ đúng thường được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn. Lượng chất chuẩn thêm vào không nên quá 40% lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng nồng độ lượng hoạt chất có trong mẫu phải nằm trong khoảng tuyển tính của phương pháp.
Tỷ lệ thu hồi (%) = (hàm lượng tìm thấy / hàm lượng thực cho vào) x 100
+ Độ lặp lại (repeatability): độ lặp lại của phương pháp được biểu thị bằng giá trị RSD (%) kết quả phân tích các mẫu độc lập trong cùng điều kiện phân tích.
f. Khảo sát vào phân tích định tính, định lƣợng mẫu đan sâm thu hái ở Sa Pa- Lào Cai
Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính thu được và phương pháp nội suy để phân tích hàm lượng cryptotanshinon trong mẫu dược liệu thu hái ở Sa Pa, Lào Cai.
2.2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft excel 2010 với một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả như sau :
Giá trị trung bình: n 1 i i x x n 1 (11)
23 Độ lệch chuẩn: S n 1 1 i 2 x xi (12)
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD)
100 x S RSD (13) Trong đó: x
: giá trị trung bình của hàm lượng hợp chất chính xi : giá trị của hàm lượng hợp chất chính của mẫu thứ i
n : số thử nghiệm được sử dụng để tính giá trị trung bình về hàm lượng của hợp chất chính
S : độ lệch chuẩn
24
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.1. Chiết xuất và tinh chế cryptotanshinon từ đan sâm
Cryptotanshinon là một diterpene quinon có nguồn gốc từ rễ của cây đan sâm (
Salvia miltiorrhiza Bunge). Tiến hành chiết xuất cryptotanshinon theo nguyên tắc chung về chiết xuất dẫn xuất phenanthraquinon.
a. Chuẩn bị dƣợc liệu
Dược liệu đan sâm thu hái tại trạm dược liệu Sa Pa (Lào Cai) đã được phơi khô
rồi thái nhỏ.
b. Lựa chọn phƣơng pháp chiết
Sử dụng phương pháp chiết sóng siêu âm. Đây là phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm có tần số lớn hơn 20Hz, có khả năng tác động mạnh vào dược chất làm tăng sự thẩm thấu dung môi chiết, tăng hòa tan dược chất, phương pháp này có thể chiết kiệt, hiệu suất cao.
c. Lựa chọn dung môi chiết
Chọn ethanol làm dung môi chiết vì ethanol hòa tan được cryptotanshinon, rẻ và không độc.
d. Chiết xuất cryptotanshinon
Mẫu rễ đan sâm (500 g) sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được ngâm chiết kỹ bằng dung môi ethanol 80% 3 lần (mỗi lần 1500 ml) sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong 4 giờ. Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 122 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 100 g cao chiết hòa tan trong nước cất (500 ml) và chiết phân bố bằng Hex, EtOAc và BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 ml). Các dịch chiết phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng Hex (6,1 g), EtOAc (26,4 g) và BuOH (17,2 g).
25
e. Phân lập cryptotanshinon từ phân đoạn tinh chế đƣợc
Từ phân đoạn hữu cơ ít phân cực hexan, phân đoạn giàu tanshinon, tiến hành phân lập sắc ký sử dụng cột nhồi silica gel (50 mm × 300 mm) với hệ dung môi rửa giải hexane-EtOAc (5:1, v/v, 2500 ml) thu được 7 phân đoạn ký hiệu là F1~F7.
Từ phân đoạn F6 (150 mg), kết hợp chạy sắc ký cột pha đảo C18 (Φ 20 mm × 400 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (3:1, v/v, 400 ml) thu được cryptotanshinon (bột màu đỏ cam, 45 mg).
26
Quy trình chiết xuất và tinh chế cryptotanshinon từ rễ cây đan sâm Đan sâm sau sơ chế (500g)
1.Chiết hồi lưu đơn giản (3 lần x 4 giờ/lần).
Dung môi EtOH 70% (1500 ml/lần)
2.Gom dịch chiết, lọc. 3. Cất quay đến khô kiệt.
Cao chiết đan sâm
( 122 g ; 19,2% khối lượng DL khô, cao khô, màu nâu sẫm)
Cao chiết đan sâm (100 g)
Khuếch tán với 500ml H2O
Dịch chiết nƣớc cao đan sâm ( 500ml)
Chiết phân bố lỏng – lỏng ( 3 lần x 500 ml/ lần) bằng Hex, EtOAc, BuOH
Phân đoạn EtOAc ( 26,4g) Phân đoạn Hex ( 6,1g) Phân đoạn BuOH ( 17,2g) Sắc ký cột silica gel (Φ50mm x 300mm) Hexane-EtOAc ( 5:1, v/v; 2500ml) F1 F2 F3 F4 F5 F6(150mg) F7 SKC pha đảo C18 (Φ20mmx400mm) MeOH-H2O ( 3:1, v/v; 400ml) Cryptotanshinon (45 mg)
27
3.1.2. Xác định cấu trúc của cryptotanshinon a. Tính chất hóa lý chung a. Tính chất hóa lý chung - Chất bột màu đỏ cam; - Nhiệt độ nóng chảy : Mp = 182-183oC; - Góc quay cực riêng: = 90o (c 1,0; CHCl3); - Phổ UV (MeOH) λmax = 270 nm. b. Các phƣơng pháp phổ
- Kết quả phổi khối ESI- MS: m/z = 297 [M + H]+
- Kết quả đo cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Sau khi phân lập, hợp chất này được xác định cấu trúc hóa học trên cơ sở các phương pháp hóa lý bao gồm phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance) và phổ khối MS (Mass Spectroscopy). Số liệu phổ thu được được phân tích chi tiết và tổng hợp ở bảng sau:
25 D
] α [
28
Bảng 3.1. Kết quả đo phổ NMR của cryptotanshinon phân lập đƣợc
Vị trí δH (số H; độ bội; J = Hz) δC δC* [38] 1 3,40 (1H, m) 3,13 (1H, m) 29,7 29,65 2 1,76 (1H, m) 1,68 (1H, m) 19,1 19,09 3 2,16 (1H, m) 1,74 (1H, m) 37,8 37,87 4 - 34,9 34,86 5 - 143,7 143,66 6 7,75 (1H, d, J = 8,0 Hz) 132,6 132,52 7 7,46 (1H, d, J = 7,6 Hz) 122,5 122,50 8 - 128,4 128,46 9 - 126,3 126,32 10 - 152,4 152,39 11 - 184,3 184,26 12 - 175,7 175,69 13 - 118,3 118,32 14 - 170,8 170,71 15 3,49 (1H, dd, J = 9,6, 6,4 Hz) 34,6 34,66 16 4,89 (1H, J = 9,6 Hz) 4,35 (1H, dd, J = 9,2, 6,4 Hz) 81,5 81,46 17 1,24 (3H, d, J = 6,8 Hz) 18,9 18,80 18 1,30 (3H, s, H-18) 31,9 31,89 19 1,32 (3H, s, H-19) 32,0 31,94
29
c. Xác định cấu trúc
Cấu trúc hóa học của của hợp chất được minh họa trong hình 3.1
Hình 3.1. Cấu trúc cryptotanshinon
Phân tích phổ 1H và 13C NMR thấy rằng đây là một diterpene tanshinon có
khung 19 cacbon. Phổ khối ESI-MS thể hiện tín hiệu ion tại m/z 297 phù hợp với ion
phân tử của cryptotanshinon là C19H20O3 (M = 296). Theo phân tích nêu trên cùng với
sự phù hợp phổ 1H và 13
C với các số liệu công bố [18,19] giúp khẳng định chính xác là cryptotanshinon.
3.1.3. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất a. Đo điểm chảy a. Đo điểm chảy
Đưa một lượng cryptotanshinon đã được nghiền mịn vào ống mao quản thuỷ tinh và xác định điểm chảy bằng máy đo điểm chảy. Tiến hành đo điểm chảy, mỗi mẫu đo 6 lần, xác định điểm chảy trung bình, so sánh với điểm chảy lý thuyết, kết quả là:
Bảng 3.2. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cryptotanshinon tinh chế đƣợc
Lần đo Nhiệt độ bắt đầu chảy (0C) Nhiệt độ chảy hoàn toàn (0C)
1 182,6 183,1 2 182,4 183,1 3 182,2 183,2 4 182,3 183,3 5 182,5 183,2 6 182,4 183,2 Trung bình 182,4 183,2 RSD (%) 0,071 0,045 O O O Tanshinone I (2)
Tanshinone IIA (1) Cryptotanshinone (3)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 O O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 O O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
30
Nhận xét: Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy nhiệt độ nóng chảy trung
bình của cryptotanshinon tinh chế được từ 182,40C đến 183,20C là phù hợp với nhiệt
độ nóng chảy của cryptotanshinon theo lý thuyết (từ 1820C đến 1830C) [25]. Điều này
chứng tỏ cryptotanshinon tinh chế có độ tinh khiết cao. Giá trị RSD thấp (0,071% và 0,045%) cho thấy kết quả đo điểm chảy khá chính xác.
b. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Trên sắc ký lớp mỏng [bản mỏng pha đảo C18, hệ pha động MeOH-H2O (5:1,
v/v)] kết quả thu được là 1 vệt rõ nét, Rf = 0,28, không có các vệt phụ, chứng tỏ cryptotanshinon thu được có độ tinh khiết cao.
Hình 3.2. Sắc ký đồ TLC của cryptotanshinon tinh chế đƣợc c. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sử dụng phương pháp tổng diện tích pic tính toán độ tinh khiết của mẫu phân tích. Tiến hành sắc ký theo chương trình trên, phân tích các pic phụ (tạp chất) trên sắc ký đồ (hình 3.3) và tính độ tinh khiết (bảng 3.3):
31
Bảng 3.3. Kết quả phân tích độ tinh khiết của cryptotanshinon tinh chế đƣợc
Cryptotanshinon
Píc cryptotanshinon Píc phụ 1 Píc phụ 2
Thời gian lưu (phút) 12,151 8,810 18,020
Diện tích pic (mAU.s) 27416 90 150
Tỷ lệ (%) 99,13 0,32 0,54
Hình 3.3. Sắc ký đồ của cryptotanshinon và mẫu trắng
Kết quả cho thấy cryptotanshinon tinh chế được có độ tinh khiết cao (> 95%) phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu. Các pic phụ (tạp chất) đều tách rõ ràng khỏi pic chất.
3.1.4. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC a. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
Trên cơ sở phân tích tài liệu tham khảo [10,16] và khảo sát về thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký với điều kiện tiến hành phân tích:
32
- Hệ thống máy HPLC: Agilent Technologies 1260 Infinity - Cột sắc ký Eclipse plus C18 (4,6x100 mm; 3,5 µm)
- Detector UV: =270 nm.
- Pha động: Acetonitril (A)–Acetic acid 0,1%/H2O (B), chương trình gradient (bảng 3.4).
- Tốc độ dòng : 0,5 ml/phút. - Dung môi pha mẫu: methanol.
- Thể tích tiêm 10 l, tiêm mẫu tự động.
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Bảng 3.4. Chƣơng trình sắc ký HPLC Thời gian ( phút) A(%) Acetonitril B(%) Acetic acid 0,1%/nƣớc 0-10 65 35 10-20 65-90 35-10 20-25 90 10 25-30 90-100 10-0 30-35 100 0 35-40 100-65 0-35 40-45 65 35 b. Độ đặc hiệu
Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích cryptotanshinon theo chương trình khảo sát trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic trong sắc ký đồ. Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của cryptotanshinon tR = 12,151 phút (hình 3.3). Vậy phương pháp phân tích cryptotanshinon xây dựng được có độ đặc hiệu cao.
33
c. Thử tính thích hợp hệ thống
Trước khi tiến hành sắc ký, cần xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký. Tiêm 6 lần dung dịch cryptotanshinon nồng độ 500 µg/ml vào hệ thống HPLC và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn ở trên. Ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng và số đĩa lý thuyết. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lƣợng cryptotanshinon tinh chế đƣợc
STT Thời gian lƣu (phút) Diện tích pic ( mAU.s) Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết 1 11,979 13707 0,96 15538 2 12,043 13745 0,95 15647 3 12,042 13952 0,95 15679 4 12,002 13899 0,95 15566 5 11,999 13875 0,95 15683 6 12,012 13751 0,95 15592 Trung bình 12,013 13821 0,95 15617 RSD ( % ) 0,19 0,66 0,39 0,36
Nhận xét: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các thông số thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử lần lượt là 0,19 % và 0,66 % đều nhỏ hơn 2 %, các giá trị của hệ số bất đối khá gần 1 (dao động từ 0,95 đến 0,96) thể hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung bình là 15617 thể hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký. Như vậy chứng tỏ rằng các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích định tính, định lượng cryptotanshinon trong dược liệu.
34
d. Khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic cryptotanshinon trên chất chuẩn cryptotanshinon.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ 1-200 μg/ml bằng cách pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần), ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích pic tương ứng. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu (bảng 3.6).
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
Dung dịch Nồng độ ( μg/ml) Diện tích (mAU.s)
1 7,813 902,3264
2 15,625 1560,5706
3 31,250 2918,4019
4 62,500 5280,5347
5 125,000 9522,1641
Phương trình hồi qui Y = 73,2520 X + 488,6700
35
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ & diện tích của pic cyptotanshinon
Nhận xét: Kết quả phương trình hồi quy tuyến tính thu được có hệ số xác định và hệ số
tương quan rất cao, độ tuyến tính chặt (hệ số tương quan R2
= 0,9977 > 0,99) (hình 3.4)
e. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ)
Giới hạn phát hiện: tiến hành pha loãng mẫu phân tích cryptotanshinon đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt khoảng 2-3. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng với từng chất. Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD.
Kết quả phân tích cho thấy khi nồng độ của cryptotanshinon là 0,49 µg/ml thì chiều cao pic = 3 lần chiều cao đường nền. Suy ra, xác định giới hạn phát hiện thu được: LOD = 0,49 µg/ml. Từ đó xác định được giới hạn định lượng LOQ = 1,63 µg/ml
f. Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng mẫu thử đồng nhất so với giá trị thực, biểu thị bằng giá trị RSD (%). Độ chính xác bao gồm độ lặp lại, độ đúng.