a. Đo điểm chảy
Đưa một lượng cryptotanshinon đã được nghiền mịn vào ống mao quản thuỷ tinh và xác định điểm chảy bằng máy đo điểm chảy. Tiến hành đo điểm chảy, mỗi mẫu đo 6 lần, xác định điểm chảy trung bình, so sánh với điểm chảy lý thuyết, kết quả là:
Bảng 3.2. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cryptotanshinon tinh chế đƣợc
Lần đo Nhiệt độ bắt đầu chảy (0C) Nhiệt độ chảy hoàn toàn (0C)
1 182,6 183,1 2 182,4 183,1 3 182,2 183,2 4 182,3 183,3 5 182,5 183,2 6 182,4 183,2 Trung bình 182,4 183,2 RSD (%) 0,071 0,045 O O O Tanshinone I (2)
Tanshinone IIA (1) Cryptotanshinone (3)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 O O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 O O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
30
Nhận xét: Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy nhiệt độ nóng chảy trung
bình của cryptotanshinon tinh chế được từ 182,40C đến 183,20C là phù hợp với nhiệt
độ nóng chảy của cryptotanshinon theo lý thuyết (từ 1820C đến 1830C) [25]. Điều này
chứng tỏ cryptotanshinon tinh chế có độ tinh khiết cao. Giá trị RSD thấp (0,071% và 0,045%) cho thấy kết quả đo điểm chảy khá chính xác.
b. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Trên sắc ký lớp mỏng [bản mỏng pha đảo C18, hệ pha động MeOH-H2O (5:1,
v/v)] kết quả thu được là 1 vệt rõ nét, Rf = 0,28, không có các vệt phụ, chứng tỏ cryptotanshinon thu được có độ tinh khiết cao.
Hình 3.2. Sắc ký đồ TLC của cryptotanshinon tinh chế đƣợc c. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sử dụng phương pháp tổng diện tích pic tính toán độ tinh khiết của mẫu phân tích. Tiến hành sắc ký theo chương trình trên, phân tích các pic phụ (tạp chất) trên sắc ký đồ (hình 3.3) và tính độ tinh khiết (bảng 3.3):
31
Bảng 3.3. Kết quả phân tích độ tinh khiết của cryptotanshinon tinh chế đƣợc
Cryptotanshinon
Píc cryptotanshinon Píc phụ 1 Píc phụ 2
Thời gian lưu (phút) 12,151 8,810 18,020
Diện tích pic (mAU.s) 27416 90 150
Tỷ lệ (%) 99,13 0,32 0,54
Hình 3.3. Sắc ký đồ của cryptotanshinon và mẫu trắng
Kết quả cho thấy cryptotanshinon tinh chế được có độ tinh khiết cao (> 95%) phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu. Các pic phụ (tạp chất) đều tách rõ ràng khỏi pic chất.
3.1.4. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC a. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
Trên cơ sở phân tích tài liệu tham khảo [10,16] và khảo sát về thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký với điều kiện tiến hành phân tích:
32
- Hệ thống máy HPLC: Agilent Technologies 1260 Infinity - Cột sắc ký Eclipse plus C18 (4,6x100 mm; 3,5 µm)
- Detector UV: =270 nm.
- Pha động: Acetonitril (A)–Acetic acid 0,1%/H2O (B), chương trình gradient (bảng 3.4).
- Tốc độ dòng : 0,5 ml/phút. - Dung môi pha mẫu: methanol.
- Thể tích tiêm 10 l, tiêm mẫu tự động.
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Bảng 3.4. Chƣơng trình sắc ký HPLC Thời gian ( phút) A(%) Acetonitril B(%) Acetic acid 0,1%/nƣớc 0-10 65 35 10-20 65-90 35-10 20-25 90 10 25-30 90-100 10-0 30-35 100 0 35-40 100-65 0-35 40-45 65 35 b. Độ đặc hiệu
Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích cryptotanshinon theo chương trình khảo sát trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic trong sắc ký đồ. Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của cryptotanshinon tR = 12,151 phút (hình 3.3). Vậy phương pháp phân tích cryptotanshinon xây dựng được có độ đặc hiệu cao.
33
c. Thử tính thích hợp hệ thống
Trước khi tiến hành sắc ký, cần xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký. Tiêm 6 lần dung dịch cryptotanshinon nồng độ 500 µg/ml vào hệ thống HPLC và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn ở trên. Ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng và số đĩa lý thuyết. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lƣợng cryptotanshinon tinh chế đƣợc
STT Thời gian lƣu (phút) Diện tích pic ( mAU.s) Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết 1 11,979 13707 0,96 15538 2 12,043 13745 0,95 15647 3 12,042 13952 0,95 15679 4 12,002 13899 0,95 15566 5 11,999 13875 0,95 15683 6 12,012 13751 0,95 15592 Trung bình 12,013 13821 0,95 15617 RSD ( % ) 0,19 0,66 0,39 0,36
Nhận xét: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các thông số thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử lần lượt là 0,19 % và 0,66 % đều nhỏ hơn 2 %, các giá trị của hệ số bất đối khá gần 1 (dao động từ 0,95 đến 0,96) thể hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung bình là 15617 thể hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký. Như vậy chứng tỏ rằng các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích định tính, định lượng cryptotanshinon trong dược liệu.
34
d. Khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic cryptotanshinon trên chất chuẩn cryptotanshinon.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ 1-200 μg/ml bằng cách pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần), ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích pic tương ứng. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu (bảng 3.6).
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
Dung dịch Nồng độ ( μg/ml) Diện tích (mAU.s)
1 7,813 902,3264
2 15,625 1560,5706
3 31,250 2918,4019
4 62,500 5280,5347
5 125,000 9522,1641
Phương trình hồi qui Y = 73,2520 X + 488,6700
35
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ & diện tích của pic cyptotanshinon
Nhận xét: Kết quả phương trình hồi quy tuyến tính thu được có hệ số xác định và hệ số
tương quan rất cao, độ tuyến tính chặt (hệ số tương quan R2
= 0,9977 > 0,99) (hình 3.4)
e. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ)
Giới hạn phát hiện: tiến hành pha loãng mẫu phân tích cryptotanshinon đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt khoảng 2-3. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng với từng chất. Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD.
Kết quả phân tích cho thấy khi nồng độ của cryptotanshinon là 0,49 µg/ml thì chiều cao pic = 3 lần chiều cao đường nền. Suy ra, xác định giới hạn phát hiện thu được: LOD = 0,49 µg/ml. Từ đó xác định được giới hạn định lượng LOQ = 1,63 µg/ml
f. Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng mẫu thử đồng nhất so với giá trị thực, biểu thị bằng giá trị RSD (%). Độ chính xác bao gồm độ lặp lại, độ đúng. y = 73.252x + 488.67 R² = 0.9977 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 0 20 40 60 80 100 120 140 D iện tí ch pic (m A U .s) Nồng độ cryptotanshinon (μg/ml)
36
+ Độ lặp lại: Độ lặp lại của phương pháp được biểu thị bằng giá trị RSD (%) kết quả phân tích các mẫu độc lập trong cùng điều kiện phân tích. Cách tiến hành pha 6 mẫu có nồng độ 50 µg/ml đo trên hệ thống sắc ký với các thông số đã xây dựng, số liệu thu được được xử lý dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính đã xây dựng ở mục d.
Bảng 3.7. Kết quả phân tích độ lặp lại của phƣơng pháp
STT Nồng độ dung dịch cryptotanshinon đo (µg/ml)
Diện tích pic (mAU.s)
Nồng độ khi thay vào đƣờng chuẩn (µg/ml) 1 50 4218,34 50,92 2 50 4317,72 52,27 3 50 4102,97 49,34 4 50 4193,23 50,57 5 50 4297,75 51,99 6 50 4303,19 52,07 Trung bình 51,20 RSD (%) 2,03
Kết quả ở bảng cho thấy với phương pháp định lượng bằng HPLC đã xây dựng, độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả định lượng khá nhỏ RSD = 2,03 %. Vậy phương pháp đã xây dựng là chính xác.
+ Độ đúng: Thêm một lượng chính xác dung dịch cryptotanshinon tinh chế được (mẫu thêm vào) vào dung dịch thử (mẫu đã có cryptotanshinon), sao cho tổng nồng độ sau khi thêm vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tiến hành phân tích sắc ký để khảo sát độ đúng, kết quả được ghi trong bảng 3.8.
37
Bảng 3.8. Kết quả phân tích độ đúng của phƣơng pháp
STT Mẫu đã có (µg) Mẫu thêm vào (µg) Tổng lƣợng tìm lại (µg) Tỷ lệ tìm lại (%) 1 109,65 30 105,20 95,94 2 112,25 30 102,21 91,06 3 109,53 30 105,72 96,52 4 110,60 30 106,58 96,37 5 114,20 30 103,22 90,39 6 113,80 30 104,93 92,21 Trung bình 93,75 RSD (%) 2,40
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp phân tích đã lựa chọn cho tỉ lệ thu hồi cao, có độ đúng tốt.
3.1.5. Sử dụng phƣơng pháp phân tích HPLC đã khảo sát vào phân tích định tính, định lƣợng mẫu đan sâm thu hái ở Sa Pa- Lào Cai
Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính thu được và phương pháp nội suy để phân tích hàm lượng cryptotanshinon trong mẫu dược liệu thu hái ở Sa Pa sử dụng trong nghiên cứu đề tài cho kết quả ở bảng 3.9 như sau:
Bảng 3.9. Kết quả phân tích định lƣợng cryptotanshinon trong đan sâm ở Sa Pa
Kết quả Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung
bình Hàm lƣợng cryptotanshinon trong
cao chiết (% khối lƣợng) 0,090 0,089 0,093 0,091 Hàm lƣợng cryptotanshinon trong
38
3.2. THẢO LUẬN
3.2.1. Phân lập và xác định cấu trúc cryptotanshinon
- Bằng cách kết hợp các kỹ thuật sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng, chúng tôi đã phân lập
được cryptotanshinon trong mẫu cây đan sâm ở Sa Pa, Lào Cai. Từ đây có thể gợi ý qui trình phân lập và xác định cấu trúc của cryptotanshinon trong phòng thí nghiệm và quy mô lớn hơn, cụ thể như sau:
+ Bước 1: Chiết xuất cryptotanshinon từ dược liệu đan sâm bằng phương pháp đun hồi lưu cách thủy ở điều kiện đã xây dựng và chiết phân bố lỏng-lỏng bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau như Hex, EtOA, BuOH thu được các phân đoạn tương ứng. + Bước 2: Phân lập cryptotanshinon từ phân đoạn hữu cơ ít phân cực hexan, bằng phương pháp sắc ký cột với các thông số cột và hệ dung môi pha động như đã chọn thu được
Hiệu suất thực tế chiết cryptotanshinon trong dược liệu khô: % H = (45.10-3.100)/500 =
0,015% (~ hàm lượng % cryptotanshinon định lượng trong dược liệu khô bằng phương pháp HPLC ( mục 3.1.5) là 0,022%) so sánh với tài liệu tham khảo [18] là 0,014% chứng tỏ phương pháp chiết xuất sử dụng có độ chính xác cao.
- Cryptotanshinon phân lập được có độ tinh khiết cao dựa trên dữ liệu sắc ký lớp mỏng, đo điểm chảy và HPLC. Cấu trúc hóa học của cryptotanshion được xác định đầy đủ dựa trên các kỹ thuật phổ như khối phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Dữ liệu phổ
khối xác định được khối lượng phân tử kết hợp với thông tin chi tiết về phổ 13C và phổ
1H NMR giúp biện giải được công thức cấu tạo của cryptotanshinon đầy đủ và chính
xác.
3.2.2. Xây dựng phƣơng pháp phân tích định lƣợng cryptotanshinon
Trên cơ sở tham khảo tài liệu và khảo sát thực tế, chọn được điều kiện sắc ký và đã khảo sát được các thông số theo quy trình:
- Điều kiện đã chọn để tiến hành phân tích:
+ Hệ thống máy: Agilent Technologies 1260 Infinity + Cột sắc ký Eclipse plus C18 (4,6 x 100 mm; 3,5 µm)
39
+ Pha động: Acetonitril (A) – Acetic acid 0,1% /nước (B), chương trình gradient như bảng 4.
+ Tốc độ dòng : 0,5 ml /phút. + Dung môi pha mẫu: methanol.
+ Thể tích tiêm 10 l, tiêm mẫu tự động.
+ Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.
- Thử tính thích hợp hệ thống: RSD = 0,66%, giá trị của hệ số bất đối khá gần 1 thể hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung bình là 15617 thể hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký.
- Khoảng tuyến tích: R2 = 0,9977; 1-200 μg/ml.
- Giới hạn phát hiện: 0,49 μg/ml; giới hạn định lượng: 1,63 μg/ml.
- Độ chính xác: khảo sát độ đúng cho kết quả RSD = 2,40% (n=6), độ lặp lại RSD = 2,03% (n=6).
=> Các thông số thu được cho thấy phương pháp lựa chọn có độ tin cậy cao.
3.2.3. Phân tích cryptotanshinon trong mẫu nghiên cứu đan sâm thu hái ở Lào Cai Cai
Trên cơ sở các tài liệu thu thập được cho thấy trong nước chưa có công bố nào phân tích cụ thể về phương pháp định lượng HPLC cryptotanshinon. Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát định lượng cryptotanshinon trong mẫu đan sâm ở Sa Pa, Lào Cai. Kết quả thu được cryptotanshinon có hàm lượng lần đầu tiên được định lượng trong dược liệu đan sâm ở Việt Nam. Kết quả đóng góp cơ sở khoa học đầy đủ hơn về thành phần hóa học của dược liệu đan sâm.
Các hợp chất diterpen tanshinon là thành phần hoạt chất chính và được coi là
chất đặc trưng của đan sâm nói riêng và các loài Salvia nói chung [35, 36, 37]. Ở nước
ta hiện nay đan sâm được khảo sát và trồng ở nhiều nơi như Tây Bắc, Phú Thọ, Hà Nội, Lâm Đồng,….Đan sâm đang được nghiên cứu nhiều và là một trong các cây dược liệu trong chiến lược phát triển của vùng Tây Bắc. Cryptotanshinon là thành phần quan trọng của đan sâm bên cạnh các hợp chất tanshinon khác. Việc phân tích định tính, định lượng cryptotanshinon có đóng góp quan trọng trong việc phân tích chất lượng
40
hoạt chất trong dược liệu đan sâm và các chế phẩm có đan sâm, gợi ý sử dụng làm chất đánh dấu trong việc quản lý chất lượng dược liệu và các sản phẩm từ đan sâm.
41
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Qua thời gian nghiên cứu đề tài chúng tôi đã thu được các kết quả theo các mục tiêu nghiên cứu đã đề ra như sau:
1. Bước đầu chiết xuất và tinh chế được cryptotanshinon từ dược liệu đan sâm. Đã tiến hành xác minh cấu trúc của cryptotanshinon tinh chế được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phương pháp phân tích khối phổ. Kết quả thực nghiệm đã khẳng định công thức phân tử cũng như cấu trúc của cryptotanshinon tinh chế được là phù hợp với lý thuyết.
2. Đã xây dựng được phương pháp HPLC để định tính, định lượng và xác định giới hạn tạp chất liên quan của cryptotanshinon tinh chế được. Kết quả đã định tính được cryptotanshinon tinh chế được, đã xác định được hàm lượng cryptotanshinon tinh chế được là 99,13% và giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan của cryptotanshinon tinh chế được là không quá 5,0%. Đã sử dụng cryptotanshinon tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng cryptotanshinon trong được liệu đan sâm thu hái ở Sa Pa, Lào Cai. Kết quả là trong mẫu dược liệu đan sâm đem kiểm nghiệm có chứa cryptotanshinon với hàm lượng là 0,022(%) – thành phần này lần đầu tiên được định lượng trong mẫu dược liệu đan sâm ở nước ta. Đây là cơ sở tiền đề để nghiên cứu đầy đủ hơn về thành phần hóa học trong các mẫu dược liệu đan sâm trồng tại Việt Nam, đồng thời định hướng cho các nghiên cứu về tác dụng dược lý của các tanshinon này.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu về phân lập các chất để có thể xác định thêm các thành phần khác trong loài đan sâm ở Lào Cai và nhiều vùng khác.
2. Khảo sát thêm các tiêu chí để xây dựng cryptotanshinon tinh chế được thành chất