Định lƣợng rutin trong hoa hòe
Phương pháp được tham khảo từ dược điển Việt Nam III [5]. - Dung dịch chuẩn
Cân chính xác 0,2 g rutin chuẩn đã sấy khô tới khối lượng không đổi vào bình định mức 100 ml. Hòa tan trong 70 ml methanol bằng cách làm ấm trong bình cách thủy. Để nguội, thêm đủ 100ml, lắc kỹ. Lấy chính xác 10 ml dung dịch này vào bình định mức 100 ml khác. Thêm nước tới vạch, lắc kỹ.
19 - Xây dựng đường cong chuẩn
Lấy chính xác lần lượt 1,0 – 2.0 – 3,0 – 4.0 – 5,0 – 6,0 ml dung dịch chuẩn cho vào các bình định mức 25 ml riêng biệt, thêm nước để đủ 6 ml ở mỗi bình rồi thêm 1 ml dung dịch NaNO2 5%, trộn kỹ. Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch Al(NO3)3 10% trộn kỹ lại để yên 6 phút. Thêm 10 ml dung dịch NaOH 10%, thêm nước tới vạch, trộn kỹ, để yên 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm. Vẽ đồ thị với trục tung là nồng độ, trục hoành là độ hấp thụ.
- Dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 1g hoa hòe đã sấy khô ở 600C trong 6 giờ cho vào bình Soxhlet. Thêm 120 ml ether, chiết tới khi dịch chiết không màu. Đề nguội, gạn bỏ ether. Thêm 90 ml methanol và chiết tới khi dịch chiết không màu. Chuyển dịch chiết vào bình định mức 100 ml, dùng methanol rửa lại bình chiết, định mức bằng methanol đến vừa đủ, lắc kỹ. Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100ml, thêm nước tới vạch, lắc kĩ. Lấy chính xác 3 ml dung dịch thu được cho vào bình định mức 25 ml, thêm 3 ml nước rồi thêm 1 ml dung dịch NaNO2 5%, trộn kỹ. Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch Al(NO3)3 10% trộn kỹ lại để yên 6 phút. Thêm 10 ml NaOH 10%, thêm nước tới vạch, trộn kỹ, để yên 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm. Tính khối lượng rutin của dung dịch thử từ nồng độ đọc được trên đường chuẩn
Chiết xuất rutin từ hoa hòe
- Chiết xuất rutin được tham khảo từ nghiên cứu của Lê Thị Mai [11]. Tiến hành chiết xuất rutin như trong hình 2.1.
20
Hình 2.1: Sơ đồ chiết xuất rutin từ hoa hòe Dược liệu
Dược liệu đã được xử lý
Dịch chiết
Dịch chiết đặc
Cắn
Dịch chiết
Dịch chiết đặc
Loại tạp thô, sấy ở 600C trong 12 giờ, xay thô
Đun hồi lưu với cồn 600
, chiết 3 lần
Cô quay thu hồi dung môi
Kết tinh qua đêm Lọc qua phễu Buchner
Sấy ở 600C qua đêm Đun hồi lưu với cồn 900
Cô quay thu hồi dung môi
Cắn
Kết tinh qua đêm
Rutin
Kiểm nghiệm
Lọc qua phễu Buchner Sấy ở 600C
21
Quy trình tiến hành
- Xử lí nguyên liệu: Hoa hòe được xát qua cho sạch bụi bẩn, sấy qua đêm ở
600C, đem đi xay thô.
- Chiết xuất: Cân 100g nguyên liệu đã xử lí cho vào bình chiết, thêm 500 ml
cồn 600 rồi đem đi đun cách thủy hồi lưu, chiết 3 lần. Gộp dung dịch thu được sau khi chiết, cô quay bốc hơi dung môi. Dịch đặc thu được để kết tinh qua đêm ở nhiệt độ phòng rồi lọc qua phễu Buchner thu rutin thô. Rutin thô sấy ở 600C qua đêm rồi tiếp tục hòa tan được với cồn 900C. Tiếp tục cô quay bốc hơi dung môi. Dịch thu được để kết tinh qua đêm ở nhiệt độ phòng, lọc qua phễu Buchner thu cắn. Sấy cắn ở 600C qua đêm, thu được rutin.
- Định lượng rutin trong sản phẩm chiết được:
Hòa tan khoảng 75,0 mg chế phẩm trong vài chục ml ethanol nóng. Lọc dung dịch qua phễu thủy tinh xốp G4 vào một bình định mức 100 ml. Rửa phễu lọc bằng ethanol nóng, để nguội và pha loãng đến vạch bằng ethanol, lắc đều. Lấy chính xác 2 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100 ml, thêm 1 ml dung dịch acid acetic 0,02 M, thêm ethanol đến vạch, lắc đều. Xác định độ hấp thụ của dung dịch thu được bằng cuvette thạch anh dày 1 cm, ở bước sóng lần lượt là 362,5 nm và 375 nm so với mẫu trắng là ethanol có chứa acid acetic 0,02 M 1%. Gọi độ hấp thụ quang của dung dịch ở 362,5 nm và 375 nm lần lượt là A362,5 và A375.
Nếu tỷ số A375/A363,5 nằm trong khoảng 0,875 ± 0,004, hàm lượng Rutin trong chế phẩm thu được được xác định theo công thức:
Trong đó : A (1%, 1cm) của rutin ở 362,5 là 325,5.
P là lượng chế phẩm khan trong mẫu thử đem đi định lượng (g).
Nếu tỷ số A375/A363,5 nằm ngoài khoảng trên thì hàm lượng rutin trong chế phẩm được xác định theo công thức sau:
( )
Khi đó lượng quercetin trong sản phẩm được tính như sau
22