vật trong bùn kỵ khí
Khi các kỹ thuật sinh học phân tử chưa phát triển, việc nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong tự nhiên dựa vào phương pháp nuôi cấy truyền thống để xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi sinh vật. Đa số các quần thể vi sinh vật trong tự nhiên không nuôi cấy được trong phòng thí nghiệm nên phương pháp này chỉ xác định được thấp hơn 1% số loài vi sinh vật có mặt trong tự nhiên.
33
Các phương pháp sinh học phân tử có thể phát hiện hầu hết các vi sinh vật có mặt trong tự nhiên. Các vi sinh vật có thể được xác định thông qua việc phân tích toàn bộ bộ gen hoặc gen chọn lọc như 16S rRNA và 18S rRNA. Dựa trên khả năng nhận biết và phân loại quần xã vi sinh vật những phương pháp này được chia thành 2 loại: phương pháp phân tích một phần quần xã vi sinh vật và phương pháp phân tích toàn bộ quần xã vi sinh vật. Bảng 1.5 đưa ra các phương pháp sinh học phân tử dùng để phân tích thành phần vi sinh vật.
Khi nghiên cứu sự biến động của hệ vi sinh vật, mỗi phương pháp sinh học phân tử đều có ưu, nhược điểm riêng. Phương pháp metagenomic nghiên cứu về hệ gen của toàn bộ vi sinh vật có trong mẫu được lấy trực tiếp từ môi trường tự nhiên mà không phải phân lập và nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm [38]. Phương pháp này đã nhân dòng các đoạn trình tự gen đặc hiệu hoặc các đoạn gen 16S rRNA để xây dựng dữ liệu về đa dạng sinh học của các mẫu môi trường. Phương pháp NGS (Next Generation Sequencing) đưa ra những cơ hội giải trình tự những mảnh ADN nhỏ có trình tự tương ứng mà không cần cloning. Khả năng giải trình tự tất cả các loài vi sinh vật giúp tìm ra những loài có phổ phát triển thấp và tác động đến việc giải thích về sự thay đổi vi sinh vật học [35]. Bên cạnh đó, phương pháp NGS có một ưu điểm lớn là có thể định lượng các loài vi sinh vật trong môi trường trong khi các phương pháp khác chủ yếu là định tính vi sinh vật.
Bảng 1.5. Các phương pháp sinh học phân tử phân tích thành phần vi sinh vật [138]
Phân tích một phần của quần thể Phân tích toàn bộ quần thể
Các kỹ thuật đánh dấu di truyền như ARDRA, SSCP, T-RFLP, DGGE, RISA, LH-PCR,
RAPD
Sự kết hợp lai ADN Phân đoạn G + C
Phương pháp thư viện dòng vô tính Giải trình tự toàn bộ bộ gen Q-PCR (real time PCR) Metagenomic
FISH, lai dot – blot Metaproteomic Phân tích lipid vi khuẩn Metatranscriptomic
DNA microarrays
Microautoradiography và isotope DNA /RNA Stable isotope probing CARD-FISH, Raman-FISH, NanoSIMS
34
Những nghiên cứu metagenomic thường được thực hiện trên rất nhiều hệ thống máy (platform) khác nhau. Hai hệ thống máy được sử dụng cho NGS phổ biến nhất là 454 pyrosequencing and Illumina (còn gọi là Solexa). Hệ thống máy Illumina thực hiện trên máy HiSeq 2000 hoặc MiSeq [151]. Hệ thống máy Illumina đọc các trình tự có độ dài 200 – 500 bp (đặc biệt HiSeq 2000 đọc các trình tự có độ dài 100 bp), trong khi đó phương pháp 454 pyrosequencing đọc được các trình tự có độ dài 400 – 600 bp [84].
Trong những năm gần đây, phương pháp NGS đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự đa dạng của vi sinh vật. Ducey và Hurt (2013) sử dụng phương pháp này để xác định sự đa dạng vi sinh vật trong hồ kỵ khí xử lý nước thải chăn nuôi, phát hiện được hai ngành chiếm ưu thế là Firmicutes (54,1%) và Proteobacteria (15,8%) [44]. Lu (2014) đã sử dụng hệ thống máy Illumina để nghiên cứu về sự phát triển cấu trúc vi sinh vật trong hạt bùn từ nhà máy đồ hộp, bia và sữa. Tác giả đã tìm ra sự biến động các thành phần vi sinh vật trong từng loại bùn hạt. Thành phần methanogen chiếm ưu thế trong bùn hạt nhà máy bia và đồ hộp là chi
Methanosaeta và chi Methanobacterium, trong bùn hạt nhà máy sữa là bộ
Methanomicrobiales [101]. Tác giả cũng sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sự phân bố của vi sinh vật trong cấu trúc hạt bùn. Các nhóm lên men chiếm ưu thế ở lớp ngoài cùng (bộ
Bacteroidales và Anaerolinea), tiếp đến là các nhóm sống cộng sinh (bộ Syntrophomonas và
Geobacter), các thành phần methanogen ở lớp giữa với hai chi chiếm ưu thế là Methanosaeta
và Methanobacterium [101]. Liao và công sự (2014) sử dụng phương pháp này để nghiên cứu quần xã vi sinh vật trong bùn hạt xử lý nước thải chứa hàm lượng sunphat và nitrat cao. Tác giả chỉ ra rằng các ngành chiếm ưu thế trong bùn hạt là Proteobacteria (77,66%), Firmicutes
(12,23%) và Chlorobi (2,71%) [95]. Hệ thống máy Illumina cũng được sử dụng để phân tích cấu trúc vi sinh vật của bùn trong quá trình xử lý nước thải giàu nitơ và photpho. Kết quả chỉ ra rằng ngành Proteobacteria và Bacteroidetes chiếm ưu thế, trong đó chi Candidatus và loài
Accumulibacter phosphatis đóng vai trò tích tụ photpho chiếm tỷ lệ lớn nhất [68]. Phương pháp NGS cũng được sử dụng để xác định sự khác nhau về tập hợp vi sinh vật trong phân hủy bùn cống với hàm lượng chất rắn cao và thấp. Kết quả cho thấy tỷ lệ các ngành Chloroflexi, Bacteroidetes và Firmicutes chiếm ưu thế trong cả hai quá trình nhưng tỷ lệ các ngành này cao hơn khi hàm lượng chất rắn cao. Chi Methanosarcina trong bùn chứa chất rắn cao cũng chiếm tỷ lệ cao hơn [100].
Như vậy, phương pháp metagenomic đã và đang được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu tập hợp vi sinh vật. Phương pháp này cho cái nhìn tổng thể về thành phần, số lượng các ngành, bộ, họ, chi, loài vi sinh vật trong từng loại nước thải khác nhau. Tuy nhiên phương pháp này có
35
nhược điểm là không phân biệt được vi sinh vật sống lẫn chết do đó sẽ hạn chế việc xác định vai trò của vi sinh vật trong tập hợp cũng như quá trình chuyển hóa vật chất của vi sinh vật.
36
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU