Hoạt tính sinh metan được xác định thông qua thể tích metan sinh ra trên lượng COD chuyển hóa trong một đơn vị thời gian (còn gọi là hiệu suất sinh khí metan) hoặc thể tích metan sinh ra trên lượng sinh khối trong một đơn vị thời gian (còn gọi là hiệu suất sinh khí metan riêng). Hạt bùn chứa tập hợp các quần thể vi sinh vật tham gia vào chuỗi thức ăn, trong đó methanogen đứng ở vị trí cuối cùng và sinh trưởng chậm nhất. Do đó, các hoạt động trao đổi chất của bùn được biểu diễn qua hoạt tính sinh metan riêng hoặc hiệu suất sinh khí metan. Bảng 1.4 trình bày hoạt tính sinh metan của một số loại bùn.
Bảng 1.4 chỉ ra thành phần nước thải khác nhau đưa đến hoạt tính sinh metan riêng hoặc/và hiệu suất sinh khí metan khác nhau. Điều này cho thấy thành phần cơ chất trong nước thải đã tác động đến sự phát triển của nhóm methanogen. Hoạt tính sinh metan riêng và hiệu suất sinh khí metan của bùn hạt được sử dụng để đánh giá sự vận hành của hệ thống.
Bảng 1.4. Hiệu suất sinh khí metan của một số loại bùn
Loại bùn trong nước thải
Hoạt tính sinh metan riêng
(gCH4-COD/gVSS.ngày)
Hiệu suất sinh khí metan
(m3CH4/kg-CODchuyển hóa)
Tài liệu tham khảo Tinh bột 0,33 [137] Hóa dược 0,32 [124] Công nghiệp 0,26 [121] Bia 0,49 0,30 [122] VFA 0,04 - 0,85 [194] Sucrose 1,2 [47] Đường thốt nốt 0,175 - 0,36 [78] Rỉ rác 0,81 [154] Metanol 0,11 - 0,27 [193] Phenol 0,45 [49] 1.7.2. Kích thước và tỷ trọng hạt bùn
Kích thước bùn hạt ảnh hưởng đến hiệu suất của hệ thống UASB. Kích thước hạt bùn quá nhỏ dẫn đến rửa trôi và không ổn định trong vận hành. Hạt bùn có kích thước quá lớn khiến hiệu quả chuyển hóa bên trong hạt kém. Bùn hạt có kích thước lớn thường liên kết với các vi khuẩn có “roi” trên bề mặt và nổi lên mặt nước dẫn đến rửa trôi một lượng lớn hạt bùn. Kích cỡ và tỷ trọng của bùn hạt phụ thuộc vào các yếu tố: thủy động lực học, OLR và loài vi sinh
32
vật,… Trong công nghiệp, phân bố kích thước hạt được ưa thích nhất là 1 - 2,0 mm. Trong các hệ thống UASB kích thước bùn hạt trong khoảng 0,5 - 5 mm, thậm chí lớn hơn. Mật độ tế bào vi sinh vật trong bùn hạt đại diện cho độ chặt của quần xã vi sinh vật. Mật độ càng cao dẫn đến tỷ trọng riêng càng lớn, tỷ trọng riêng của bùn hạt trong khoảng 1,033 – 1,065 g/cm3
[128]. Tỷ trọng bùn hạt càng lớn thì tốc độ lắng càng nhanh. Khả năng lắng tốt dẫn đến sự phân tách bùn khỏi dòng ra.
1.7.3. Chỉ số thể tích bùn lắng
Chỉ số thể tích bùn lắng (SVI) là chỉ tiêu để đánh giá khả năng lắng của bùn. Bùn có SVI càng nhỏ, khả năng lắng càng cao và mật độ tế bào càng dày đặc. Mục tiêu chính của giai đoạn khởi động trong hệ thống UASB là phát triển bùn hạt có SVI thấp từ bùn phân tán. Giá trị SVI càng thấp thì khả năng duy trì bùn trong hệ thống càng tốt. SVI của bùn hạt từ 10 – 20 mL/g, bông bùn từ 20 – 40 mL/g [55].
1.7.4. Độ bền cơ học
Độ bền phản ánh độ rắn chắc và cấu trúc ổn định của bùn hạt. Chúng được đánh giá bằng phương pháp siêu âm và đo độ đục [135]. Độ bền của bùn hạt cũng được đánh giá thông qua hệ số bảo toàn (là tỷ số chất rắn bị nổi trên tổng khối lượng bùn hạt được lắc trong 5 phút với tốc độ 200 rpm). Hệ số bảo toàn càng thấp độ bền của hạt càng lớn. Hệ số này tượng trưng cho khả năng chống lại sự mài mòi và lực cắt [56].
1.7.5. Màu sắc
Bùn hạt thường có bề mặt màu đen hoặc xám trắng. Khi tải trọng hữu cơ và tốc độ dòng chất lỏng chảy ngược thấp hình thành các hạt bùn nhẹ hơn với trung tâm bị rỗng, có màu xám hoặc màu trắng, kết cấu mềm yếu và có thể bị phá vỡ lớp vỏ hạt. Khi OLR cao và HRT ngắn, các hạt tồn tại màu đen với cấu trúc rắn chắc, dày đặc. Màu sắc của bùn hạt phụ thuộc vào loài vi sinh vật, thành phần hóa học và cấu trúc ba chiều. Sự thay đổi màu sắc hạt bùn có thể phản ánh sự thay đổi trong trao đổi chất và thành phần của bùn hạt.
1.8. Một số phương pháp sinh học phân tử ứng dụng trong xác định thành phần vi sinh vật trong bùn kỵ khí vật trong bùn kỵ khí
Khi các kỹ thuật sinh học phân tử chưa phát triển, việc nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong tự nhiên dựa vào phương pháp nuôi cấy truyền thống để xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi sinh vật. Đa số các quần thể vi sinh vật trong tự nhiên không nuôi cấy được trong phòng thí nghiệm nên phương pháp này chỉ xác định được thấp hơn 1% số loài vi sinh vật có mặt trong tự nhiên.
33
Các phương pháp sinh học phân tử có thể phát hiện hầu hết các vi sinh vật có mặt trong tự nhiên. Các vi sinh vật có thể được xác định thông qua việc phân tích toàn bộ bộ gen hoặc gen chọn lọc như 16S rRNA và 18S rRNA. Dựa trên khả năng nhận biết và phân loại quần xã vi sinh vật những phương pháp này được chia thành 2 loại: phương pháp phân tích một phần quần xã vi sinh vật và phương pháp phân tích toàn bộ quần xã vi sinh vật. Bảng 1.5 đưa ra các phương pháp sinh học phân tử dùng để phân tích thành phần vi sinh vật.
Khi nghiên cứu sự biến động của hệ vi sinh vật, mỗi phương pháp sinh học phân tử đều có ưu, nhược điểm riêng. Phương pháp metagenomic nghiên cứu về hệ gen của toàn bộ vi sinh vật có trong mẫu được lấy trực tiếp từ môi trường tự nhiên mà không phải phân lập và nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm [38]. Phương pháp này đã nhân dòng các đoạn trình tự gen đặc hiệu hoặc các đoạn gen 16S rRNA để xây dựng dữ liệu về đa dạng sinh học của các mẫu môi trường. Phương pháp NGS (Next Generation Sequencing) đưa ra những cơ hội giải trình tự những mảnh ADN nhỏ có trình tự tương ứng mà không cần cloning. Khả năng giải trình tự tất cả các loài vi sinh vật giúp tìm ra những loài có phổ phát triển thấp và tác động đến việc giải thích về sự thay đổi vi sinh vật học [35]. Bên cạnh đó, phương pháp NGS có một ưu điểm lớn là có thể định lượng các loài vi sinh vật trong môi trường trong khi các phương pháp khác chủ yếu là định tính vi sinh vật.
Bảng 1.5. Các phương pháp sinh học phân tử phân tích thành phần vi sinh vật [138]
Phân tích một phần của quần thể Phân tích toàn bộ quần thể
Các kỹ thuật đánh dấu di truyền như ARDRA, SSCP, T-RFLP, DGGE, RISA, LH-PCR,
RAPD
Sự kết hợp lai ADN Phân đoạn G + C
Phương pháp thư viện dòng vô tính Giải trình tự toàn bộ bộ gen Q-PCR (real time PCR) Metagenomic
FISH, lai dot – blot Metaproteomic Phân tích lipid vi khuẩn Metatranscriptomic
DNA microarrays
Microautoradiography và isotope DNA /RNA Stable isotope probing CARD-FISH, Raman-FISH, NanoSIMS
34
Những nghiên cứu metagenomic thường được thực hiện trên rất nhiều hệ thống máy (platform) khác nhau. Hai hệ thống máy được sử dụng cho NGS phổ biến nhất là 454 pyrosequencing and Illumina (còn gọi là Solexa). Hệ thống máy Illumina thực hiện trên máy HiSeq 2000 hoặc MiSeq [151]. Hệ thống máy Illumina đọc các trình tự có độ dài 200 – 500 bp (đặc biệt HiSeq 2000 đọc các trình tự có độ dài 100 bp), trong khi đó phương pháp 454 pyrosequencing đọc được các trình tự có độ dài 400 – 600 bp [84].
Trong những năm gần đây, phương pháp NGS đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự đa dạng của vi sinh vật. Ducey và Hurt (2013) sử dụng phương pháp này để xác định sự đa dạng vi sinh vật trong hồ kỵ khí xử lý nước thải chăn nuôi, phát hiện được hai ngành chiếm ưu thế là Firmicutes (54,1%) và Proteobacteria (15,8%) [44]. Lu (2014) đã sử dụng hệ thống máy Illumina để nghiên cứu về sự phát triển cấu trúc vi sinh vật trong hạt bùn từ nhà máy đồ hộp, bia và sữa. Tác giả đã tìm ra sự biến động các thành phần vi sinh vật trong từng loại bùn hạt. Thành phần methanogen chiếm ưu thế trong bùn hạt nhà máy bia và đồ hộp là chi
Methanosaeta và chi Methanobacterium, trong bùn hạt nhà máy sữa là bộ
Methanomicrobiales [101]. Tác giả cũng sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sự phân bố của vi sinh vật trong cấu trúc hạt bùn. Các nhóm lên men chiếm ưu thế ở lớp ngoài cùng (bộ
Bacteroidales và Anaerolinea), tiếp đến là các nhóm sống cộng sinh (bộ Syntrophomonas và
Geobacter), các thành phần methanogen ở lớp giữa với hai chi chiếm ưu thế là Methanosaeta
và Methanobacterium [101]. Liao và công sự (2014) sử dụng phương pháp này để nghiên cứu quần xã vi sinh vật trong bùn hạt xử lý nước thải chứa hàm lượng sunphat và nitrat cao. Tác giả chỉ ra rằng các ngành chiếm ưu thế trong bùn hạt là Proteobacteria (77,66%), Firmicutes
(12,23%) và Chlorobi (2,71%) [95]. Hệ thống máy Illumina cũng được sử dụng để phân tích cấu trúc vi sinh vật của bùn trong quá trình xử lý nước thải giàu nitơ và photpho. Kết quả chỉ ra rằng ngành Proteobacteria và Bacteroidetes chiếm ưu thế, trong đó chi Candidatus và loài
Accumulibacter phosphatis đóng vai trò tích tụ photpho chiếm tỷ lệ lớn nhất [68]. Phương pháp NGS cũng được sử dụng để xác định sự khác nhau về tập hợp vi sinh vật trong phân hủy bùn cống với hàm lượng chất rắn cao và thấp. Kết quả cho thấy tỷ lệ các ngành Chloroflexi, Bacteroidetes và Firmicutes chiếm ưu thế trong cả hai quá trình nhưng tỷ lệ các ngành này cao hơn khi hàm lượng chất rắn cao. Chi Methanosarcina trong bùn chứa chất rắn cao cũng chiếm tỷ lệ cao hơn [100].
Như vậy, phương pháp metagenomic đã và đang được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu tập hợp vi sinh vật. Phương pháp này cho cái nhìn tổng thể về thành phần, số lượng các ngành, bộ, họ, chi, loài vi sinh vật trong từng loại nước thải khác nhau. Tuy nhiên phương pháp này có
35
nhược điểm là không phân biệt được vi sinh vật sống lẫn chết do đó sẽ hạn chế việc xác định vai trò của vi sinh vật trong tập hợp cũng như quá trình chuyển hóa vật chất của vi sinh vật.
36
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1.1.Nước thải
1. Nước thải được lấy tại mương đông tụ của nhà máy sơ chế mủ cao su trên địa bàn tỉnh Thanh Hóa. Nước thải sơ chế mủ cao su được chứa trong can dung tích 20L, dự trữ ở nhiệt độ phòng.
2. Nước thải sơ chế mủ cao su đánh đông trong phòng thí nghiệm từ mủ cao su cô đặc có hàm lượng chất khô 52 – 54% (công ty cổ phần cao su Merufa) được chuẩn bị theo quy trình đánh đông mủ cao su của nhà máy. Sơ đồ đánh đông như sau:
a-Nước thải từ nhà máy sơ chế mủ cao su b-Nước thải đánh đông trong phòng thí nghiệm
Hình 2.1. Nước thải đánh đông mủ cao su
Trộn đều 2L mủ li tâm DRC 26 - 27% Trộn đều Để động tụ trong 8 giờ 1L mủ li tâm DRC 52 - 54%
1L nước máy 2L axetic 2%
Nước thải
37
2.1.1.2.Rỉ đường
Rỉ đường (nhà máy đường Lam Sơn, Thanh Hóa) có thành phần như sau: COD tổng: 695 ± 32 (mg/g), BOD: 498 ± 21(mg/g), TN: 16,0 ± 1,2 (mg/g) và pH 4,3.
2.1.1.3.Bùn giống
Bùn giống được lấy từ hệ thống xử lý kỵ khí nước thải nhà máy tinh bột sắn Yên Bình (Yên Bái) và được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.
2.1.2. Hóa chất
2.1.2.1.Các hóa chất phân tích
- Hóa chất phân tích COD: bộ kit đo COD (HACH, Mỹ) gồm 2 loại kit đo với 1 loại có khoảng đo từ 100-1500 mg/L và 1 loại có khoảng đo từ 0-150 mg/L.
- Hóa chất phân tích TN: bộ kit đo TN (HACH, Mỹ) với khoảng đo chính xác từ 0-150 mg/L.
- Hóa chất sử dụng trong phân tích:
+ Axit axetic, axit propionic, axit N-butyric, axit Iso-butyric, axit N-valeric, axit Iso- valeric (Wako, Nhật Bản)
+ CH3COONa, C2H5COONa, NH4Cl, CaCl2·2H2O, MgCl2·6H2O, MgSO4·7H2O, KH2PO4, K2HPO4·3H2O, Na2HPO4·7H2O, FeCl2·4H2O, FeCl3·6H2O, CoCl2·6H2O, ZnCl2, H3BO3, MnCl2·2H2O, NiCl2·6H2O, CuCl2·2H2O, Na2MoO4·2H2O, EDTA, NaOH, resazurin, alcylthioure (Sigma, Mỹ).
- Hóa chất trong sinh học phân tử:
+ Tách chiết ADN: Fast DNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, Mỹ);
+ Mồi: 515F (5′- AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT ATG GTA ATT GTG TGC CAG CMG CCG CGG TAA -3′) và 806R (5′-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT ACG AGA CTG ATT AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTAAT-3′) [36].
+ Miseq reagent kit v.2 (Illumia, Mỹ)
+ Tinh sạch sản phẩm PCR: MinElute PCR purification kit (QIAGEN);
2.1.2.2.Hóa chất dùng để xử lý nước thải + Axit axetic, AlCl3, NaOH (Trung Quốc).
38
2.1.3. Thiết bị
2.1.3.1.Hệ thống UASB quy mô 20L
- Kích thước làm việc của UASB là 1440 x 104 x 104 mm.
- Nhiệt độ của UASB được duy trì ở 35 oC bằng tuần hoàn nước nóng trong áo giữ nhiệt.
a. Sơ đồ mô hình hệ thống UASB b. Thiết bị UASB
(1) Thùng chứa nước thải dòng vào; (2) Bơm; (3) Bộ phận tách khí;
(4) Bộ phận khuấy trộn; (5) Bộ phận khử H2S; (6) Đồng hồ đo khí; (7) Bể ổn nhiệt Hình 2.2. Sơ đồ hệ thống UASB
2.1.3.2.Thiết bị bẫy cao su
- Dung tích thiết bị: 43L.
- Nhiệt độ làm việc: nhiệt độ phòng. - Nguyên lý vận hành thiết bị:
39
Thiết bị bẫy cao su được thiết kế dựa trên nguyên lý làm việc của thiết bị vách ngăn (BR) (hình 2.3). Nước thải được bơm vào thiết bị BR theo chiều từ trên xuống và đi theo đường zic zắc trong thiết bị BR. Hạt cao su có tỉ trọng nhỏ hơn sẽ nổi lên mặt nước và được giữ lại. Nước đi ra khỏi thiết bị sẽ giảm SS và COD. Thời gian lưu (HRT) nước thải trong thiết bị BR là 23 giờ.
a. Sơ đồ mô hình thiết bị bẫy cao su (BR) b. Thiết bị bẫy cao su
Thùng chứa nước thải vào; 2- Bơm; 3- Bẫy cao su; 4- Thùng chứa nước thải ra Hình 2.3. Sơ đồ thiết bị bẫy cao su (BR)
2.1.3.3.Các thiết bị phân tích
- pH meter cầm tay HORIBA AS211 (Nhật Bản)
- Thiết bị phân tích đa chỉ tiêu môi trường DR 2800 (Hach, Mỹ) - Thiết bị phá mẫu DRB 200 (Hach, Mỹ)
- Thiết bị phân tích BOD (WTW12, Đức) - Máy sắc ký GC-8A (SHIMAZU, Nhật Bản) - Máy sắc ký GC-2014 (SHIMAZU, Nhật Bản)
- Sắc ký lỏng cao áp LC-20AD (SHIMADZU, Nhật Bản) - Tủ sấy ETTAS-540S (Nhật Bản).
- Tủ nung (Nhật Bản).
- Cân điện tử AU-W220 (SHIMADZU, Nhật Bản)
- Máy bơm hút chân không A-1000S (EYELA, Nhật Bản) - Đồng hồ đo khí kiểu ướt WS-1A (Shinagawa, Nhật Bản)
40
- Hệ thống Miseq (Illumina)
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp phân tích 2.2.1. Các phương pháp phân tích
2.2.1.1.Xác định pH
- Xác định theo TCVN 6492-2011 (ISO 10523:2008) [6]. - Sử dụng pH meter cầm tay, đo trực tiếp tại hệ thống.
2.2.1.2.Tổng chất rắn lơ lửng
Hàm lượng chất rắn lơ lửng (SS) được xác định bằng cách lọc một thể tích mẫu qua giấy lọc có đường kính lỗ 0,45 μm. Thu phần cặn và sấy ở nhiệt độ 105 oC trong 2 giờ [18].
2 1 *1000 m m SS V Trong đó:
m2 - Khối lượng mẫu sau khi sấy ở 105 oC (mg); m1 - Khối lượng giấy lọc trước khí sấy (mg); V - Thể tích mẫu được lọc (mL).
2.2.1.3.Xác định chất rắn lơ lửng bay hơi
Hàm lượng chất rắn lơ lửng bay hơi (VSS) được xác định thông qua nung lượng chất rắn (SS) ở 550 oC trong 30 phút [18]. 2 3 *1000 m m VSS V Trong đó:
m2 - Khối lượng mẫu sau khi sấy ở 105 oC (mg); m3 - Khối lượng mẫu sau khi nung ở 550 oC (mg); V - Thể tích mẫu được lọc (mL).
2.2.1.4.Hàm lượng nitơ
Hàm lượng nitơ tổng (TN) được phân tích bằng bộ kit đo TN chuẩn của hãng HACH. Quy trình đo TN dựa trên quy trình chuẩn kèm theo của hãng với máy phân tích chất lượng nước DR-2800 (HACH) [63].
(mg/L)
41
2.2.1.5.Hàm lượng các ion NH4+có trong nước thải
Mẫu nước thải được thu nhận và được bảo quản ở nhiệt độ -20 oC. Hàm lượng ion NH4+ được phân tích bằng phương pháp sắc ký ion cao áp với máy sắc ký LC-20ADsp (SHIMADZU) [68].
2.2.1.6.Nhu cầu oxy hóa học (COD)
Phân tích COD sử dụng bộ kit đo COD chuẩn của hãng HACH [63]. Quy trình phân tích