II.1 Hoa lily
Có thể nuôi cấy nhiều bộ phận của hoa lily, xong nuôi cấy bằng vảy củ, lát cắt vòi nhụy, bầu nhụy, cho tỉ lệ phôi cao hơn cả.
II.1.1 Quy trình tạo củ nhân giống hoa lily từ lát cắt vảy củ * Đối tượng : giống hoa lily longiflorumthunb:(L4)
- Vật liệu nghiên cứu : sử dụng lát cắt ngang có chiều dày 1-1,5mm. Tách từ củ invitro có đường kính 4-10mm.
* Phương pháp nuôi cấy
- Tạo cụm củ từ lát cắt ngang vảy củ invitro
- Điều kiện nuôi cấy : nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn - Môi trường nuôi cấy là môi trường MS bổ sung BAP 0,3 mg/l α-
NAA 0,05mg/l, Agar 5g/l, đường sucrose 90g/l. * Quy trình:
- Sử dụng các củ invitro có đường kính 4-5mm,tách các vảy củ và cắt thành lát có chiều dày 1- 1,5mm. Khả năng tạo củ phụ thuộc vào kích thước và vị trí lát cắt vảy củ invitro. Lát cắt càng sát phần gốc củ thì càng cho tỷ lệ phát sinh củ cao.
- Nuôi cấy lát cắt trên môi trường tạo củ:
Môi trường: MS bổ sung BAP 0,3 mg/l kết hợp α_NAA 0,05 mg/l , đường sucrose 90g/l, than hoat tính 0,1g/l và dịch chiết malt 0,5g/l.
-Củ hình thành được lấy chuyển sang môi trường thích hợp để tăng trọng lượng củ và kích thước củ: MS bổ sung BAP 0,05mg/l kết hợp NAA 0,3mg/l và đường sucrose 90g/l.
- Củ đạt kích thước và trọng lượng cần thiết được xử lý lạnh ở 40C trong 2 -3 tuần, sau đó chuyển ra vườn ươm trên giá thể trấu hun, đất phù sa, bọt núi lửa trộn tỷ lệ 1:1:1.
Quy trình kỹ thuật Tái sinh phôi từ mô sẹo
Lát cắt ngang vảy củ dày 1-1,5mm từ củ invitro có đường kính 4-10mm.
MS bổ sung BAP 0,3mg/l, α_NAA 0,05mg/l,đường sucrose 90g/ml,than 0,1g/ml,ME 0,5g/ml.
MS bổ sung BAP 0,05mg/l, α_NAA 0,3mg/l,đường sucrose 90g/ml.
2-3 tuần
Giá thể: Đất phù sa,bọt núi lửa,trấu hun (tỷ lệ 1:1:1)
II.1.2 Quy trình tạo phôi vô tính và củ in vitro từ lát cắt ngang vòi nhụy và bầu nhụy.
•Đối tượng vật liệu nuôi cấy.
- Giống hoa Lily lai Lilium oriental
- Sử dụng lát cắt ngang có chiều dày 0,2 - 0,4mm (bầu nhụy) hoặc 0,7- 1mm (vòi nhụy) từ chồi non chưa hé cành.
•Phương pháp
- Môi trường nuôi cấy là môi trường MS bổ sung các chất kích thích sinh trưởng:
+ Kinetin: 0,1-0,2mg/l + NAA: 0,5-2mg/l + 2,4D: 1-1,5-2mg/l
- Môi trường: pH = 5,8. Nhiết độ nuôi cấy là: 25±10C •Quy trình
- Khử trùng:
+ Nụ non khi thụ hái về được rửa sạch qua vòi nước chảy + Tráng lại bằng nước cất 2 - 3 lần
+ Ngâm trong dung dịch H2O2 20% trong 10 phút Vật liệu KĐ Tạo củ Tăng trọng lượng củ Xử lý lạnh ở 40C
Đưa cây ra vườn ươm
+ Tráng sạch bằng nước cất vô trùng 2 – 4 lần.
Mẫu vô trùng được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo phôi hoá. - Môi trrường tạo mô sẹo phôi hoá:
+ Với lát cắt bầu nhụy:
Môi trường MS có bổ sung 2,4D 1,5mg/l, Kinetin 0,1mg/l + Với lát cắt vòi nhụy:
Môi trường MS bổ sung α- NAA 1mg/l, Kinetin 0,1mg/l.
- Môi trường nhân nhanh mô sẹo phôi hoá: Mô sẹo phôi hoá có nguồn gốc khác nhau được nhân nhanh trong môi trường có các chất KTST khác nhau:
+ Từ bầu nhụy: MS + 2,4D 0,5 mg/l + Kinetin 0,1 mg/l. +Từ vòi nhụy: MS + 0,5mg/l α- NAA + Kinetin 0,1 mg/l.
Nuôi cấy luân chuyển môi trường đặc => lỏng và ngược lại có tác dụng tốt đối với nhân nhanh phôi hoá, làm tăng sinh khối mô sẹo và cải thiện chất lượng mô sẹo.
- Môi trường tạo phôi: Mô sẹo phôi hoá phát sinh phôi với tỷ lệ cao trong môi trường:
+ Từ vòi nhụy: MS + BAP 0,3mg/l + α- NAA 0,05mg/l + Sucrose 90g/l.
+ Bầu nhụy: MS + BAP 0,3mg/l + sucrose 90g/l + 2,4 D 0,5mg/l. - Môi trường tái sinh cây từ phôi vô tính: MS + 90g/l sucrose, không
có chất KTST.
Quy trình
Lát cắt ngang vòi nhụy dày Lát cắt ngang bầu
nhụy dày
0,7-1mm 0,2-0,4mm.
MS+ 0,1 mg/l Kinetin + 1mg/l MS + 2,4D 1,5mg/l + 0,1
α_NAA hoặc 0,2mg/l Kinetin
Đặc Lỏng MS+ α- NAA 0,5mg/l MS+2,4D 0,5mg/l + 0,1mg/l Kinetin + Kinetin 0,1mg/l Vật liệu ban đầu
Tạo mô sẹo
MS+ 2,4D 0,5mg/l MS+0,3mg/l BAP + 90g sucrose +0,05mg/l α_NAA+90g/l sucrose MT MS + 90g/l sucrose và không có kích thích sinh trưởng
II.2 Hoa Hồng Môn
II.2.1 Đối tượng và phương pháp:
- Chọn cây bố mẹ sinh trưởng tốt, hoa đẹp, lấy lá non không sâu bệnh có chiều dài 1/3 – 1/2 so với lá trưởng thành làm vật liệu khởi đầu. * Phương pháp
- Chuẩn bị mẫu cấy: Khử trùng mẫu bằng xà phòng, cồn, HgCl2 0,1%. - Mẫu lá non vô trùng cắt thành mảnh có kích thước 1x 1cm2 Cấy
vào môi trường tạo mô sẹo. - Môi trường tạo mô sẹo:
Môi trường ½ MS (không giảm CaCl2.2H20 và MgS04.7H2O) + 30g/l Sucrose + 1mg/l BA, 0,08 mg/l 2,4D, 8g/l Agar.( pH = 6)
- Nhân nhanh mô sẹo:
• Cụm mô sẹo có kích thước: 0,1 – 1mm đưa vào môi trường lỏng để tăng sinh khối.
• Môi trường lỏng tăng sinh mô sẹo: ½ MS (NH4NO3 1/8 ) + 30g/l surose + 100 mg/l CH + 2,4 D 0,2 – 1 mg/l (NAA 0,2 – 1 mg/l) + BAP 0,5 mg/l . Nuôi cấy lắc với tốc độ 80 – 90 v/p.
- Môi trường tái sinh chồi bất định qua nuôi cấy lỏng kết hợp với nuôi cấy đặc:
+ Nuôi cấy lỏng: Các mẫu mô sẹo có kích thước 7,5 x 7,5 mm được đưa vào môi trường tái sinh.
Môi trường: ½ MS lỏng ( ngoại trừ NH4 NO3 là 1/8) + 20g/l sucrose + 1mg/l BA, pH = 5,7.
+ Môi trường đặc tái sinh chồi:
½ MS + 30 g/l sucrose + 10% CW + 0,3 mg/l BAP + 0,1 mg/l IAA + GA3
0,1 mg/l .
Quy trình Tạo phôi vô
tính
Vật liệu khử trùng: Rửa sạch lá non Mô lá bằng nước xà phòng + vài giọt Tween
80 trong 10-15 phút rửa sạch lại bằng nước cất lắc cồn 70% trong 30s tráng lại bằng nước cất vô trùng 3-4 lần ngâm trong HgCl2 0,1% trong 7 phút rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần.
½ MS (NH4NO3 1/8) + 1-2 mg/l BAP
Nuôi cấy bước 1: Nuôi cấy bước 2:
MT lỏng tĩnh ½MS + 1mg/l BAP - MT lỏng lắc (20 ml/bình,80-90 vòng/phút: ½MS+BAP 0,5mg/l+NAA (2,4D) 0,6mg/l. - MT đặc: ½MS + BAP 0,3mg/l + IAA 0,1mg/l + 0,1-10mg/l GA3
Giá thể tảo biển,mùn cưa sạch bệnh,giữ độ ẩm và thoáng khí. Vật liệu khởi đầu
Tạo mô sẹo
Tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo