I.1 Đối tượng nghiên cứu, áp dụng:
Một số cây ăn quả có múi ở địa phương và nhập nội như : bưởi Phúc Trạch, cam Vân Du, cam Sành, quýt Chum, quýt Đường Canh, Quýt lai Murcott được sử dụng trong nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá và phôi vô tính.
Sử dụng noãn trước và sau thụ phấn ở các độ tuổi khác nhau ( từ 1-8 tuần tuổi).
* Cách làm
- Sau khi hoa được thụ phấn, nhụy cái rụng, bầu nhụy phát triển thành quả non.
- Quả non của các giống nghiên cứu được thu hái ở 1- 8 tuần tuổi, kể từ sau khi hoa tung phấn.
- Bầu nhụy cái và quả non thu về, được khử trùng rồi tách lấy noãn ( noãn sau khi thụ tinh phát triển thành hạt non) nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo.
- Với quả non từ 6, 7, 8 tuần phải tách bỏ vỏ lụa bên ngoài hạt non sau đó loại bỏ phôi non rồi cấy vào môi trường.
- Tất cả các thao tác trên đều được thực hiện dưới kính hiển vi 80i nổi. I.3 Phương pháp
Tiến hành nuôi cấy noãn và hạt non trên môi trường
MS bổ sung 10g/ml myo inositol,2mg/l glycin,1mg/l pyridoxin,1mg/l nicotic acid,5mg/l thiamin,1mg/l asparagin.( chia làm 2 cột : 1 bên là hóa chất, 1 bên là nồng độ)
* Khử trùng
- Quả non được khử trùng bằng 2 loại hoá chất là Ca(ClO)2 nồng độ 6% và HgCl2 nồng độ 0,01%
- Tách lấy noãn vô trùng từ quả non. * Môi trường tạo mô sẹo phôi hoá
- Môi trường cơ bản bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau: -0,5; 1,0 -2,0(mg/l) ứng với từng giống khác nhau, 500mg/l malt tract; 50g/l đường; 5g/l thạch.
- pH môi trường được chỉnh đến pH = 5,8. - Noãn nuôi trên đĩa petri để trong tối.
- Mô sẹo được nuôi trong môi trường đặc, thời gian 1 tháng => chuyển sang môi trường lỏng 2 tuần => nhân tiếp trong môi trường đặc.
- Nhiệt độ nhân nuôi mô sẹo ở 25 – 270C trong điều kiện chiếu sáng 2400 lux, thời gian là 8h/ ngày.
* Môi Trường tạo phôi:
- Môi trường G1?????: Bổ sung 1,0 mg/l GA3, 30g/l đường, 5g/l Agar. - Môi trường G2????: Bổ sung 1,5mg/l GA3, 30g/l đường, 5g/l Agar. - Môi trường BG????: bổ sung 1,0 mgl/l GA3 kết hợp 0,2 mg/l BAP,
5g/l Agar.
* Môi trường nảy mầm phôi vô tính:
- Môi trường MS có bổ sung 30g/l đường, không chứa chất điều hoà sinh trưởng.
I.4 Quy trình - Khử trùng:
+ Quả non khi được thu hái về phải rửa sạch dưới vòi nước chảy rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần
+ Ngâm trong dung dịch hypoctorit canxi Ca(ClO)2 6% trong 15phút + Tráng sạch bằng nước cất vô trùng 2-3 lần, sau đó tách noãn vô trùng để cấy.
- Tạo mô sẹo phôi hoá:
+ Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hoá từ nuôi cấy noãn và hạt non phụ thuộc vào tuổi quả. Với cam Vân Du ở 6 tuần tuổi, cam Sành ở 2 tuần tuổi, Quýt Chum và quýt Đường Canh ở tuần tuổi 1,7 và 8 cho tỷ lệ phôi hoá cao nhất.
+ Môi trường: MS bổ sung 500mg/l malt extract, 5g/l Agar và BAP với nồng độ khác nhau tương ứng với các giống: 2mg/l (cam Vân Du), 2mg/l (cam Sành), 1g/l (quýt Chum) và 0,5mg/l (quýt Đường Canh). - Nhân mô sẹo phôi hoá:
Môi trường MS có bổ sung 500mg/l malt extract, 30g/l đường và nồng độ BAP thích hợp theo chu kì nuôi cấy trên môi trường đặc => lỏng đặc => bioreactor => đặc.
- Tái sinh phôi vô tính và cây invitro: Mô phôi hoá có xu hướng tạo phôi vô tính trên môi trường có hàm lượng BAP thấp, nếu nồng độ BAP cao hơn các phôi có xu hướng phát triển không bình thường. Phôi vô tính đã nảy mầm, phát triển tốt trên môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng.
QUY TRÌNH
Quả non sau thụ phấn 1-8 tuần.
Mt MS bổ sung 500mg/l malt extract, 5g/l Agar, 50g/l đường,BAP 0,5-2mg/l.
Đặc => lỏng lắc => bioreactor => đặc. Vật liệu ban đầu
Nhân mô sẹo phôi hoá Tạo mô sẹo phôi
Mt MS bổ sung 500mg/l malt extract,50g/l đường,BAP nồng độ <0,5mg/l.
Mt MS không có chất điều hòa sinh trưởng,