NARINGINASE THÔ
Dung dịch enzyme naringinase thô sau khi sinh tổng hợp sẽ được bổ sung maltodextrin đã hồ hóa vào (% w/v) theo các tỉ lệ khảo sát. Và maltodextrin bổ sung chính là lượng maltodextrin so với khối lượng dung dịch mẫu đem bảo quản, không tính lượng nước dùng để hòa tan. Tiến hành bảo quản ở hai nhiệt độ 40C và -160C. Sau các khoảng thời gian dự kiến, mẫu được đem phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Davis – 1947.
Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin và nhiệt độ bảo quản đến hoạt tính enzyme naringinase Hoạt tính (UI/ml) Nồng độ maltodextrin (%) Nhiệt độ (oC) 0 10 20 30 Trung bình (nhiệt độ) 4 12,040 12,007 11,925 11,844 11,954a -16 11,949 11,976 11,985 11,909 11,955a Trung bình (nồng độ) 11,995 a 11,991a 11,955a 11,876b
Các chữ cái a, b, c,.. trong cùng một cột hoặc một hàng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%.
Kết quả cho thấy hoạt tính enzyme naringinase thô bảo quản ở -160C và 40C không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên kết quả cũng chỉ ra rằng bảo quản ở nhiệt độđông -160C ổn định hơn ở 40C. Nguyên nhân là do ởđiều kiện lạnh đông, các hoạt động sinh hóa, vi sinh của hợp chất bị kìm hãm, đồng thời sự biến tính của enzyme cũng như tác dụng phân giải của các enzyme proteolytic có mặt trong dịch chiết bị hạn chế. Đồng thời cấu trúc của maltodextrin ít thay đổi, giúp bảo vệ enzyme tốt hơn.
10,00 10,50 11,00 11,50 12,00 12,50 13,00 0 1 2 3 4 5 Ngày bảo quản H o ạ t tí n h ( U I/ m l) 0% 10% 20% 30% 10,00 10,50 11,00 11,50 12,00 12,50 13,00 0 1 2 3 4 5 Ngày bảo quản H o ạ t tí n h ( U I/ m l) 0% 10% 20% 30%
Hình 19: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở 40C, theo nồng độ maltodextrin và thời gian
Từ kết quả ở hình 19 cho thấy khi tồn trữở nhiệt độ lạnh 40C, hoạt tính enzyme có xu hướng giảm trong 2 ngày đầu tiên và sau đó hệ enzyme ổn định nên hoạt tính bắt đầu tăng lên. Riêng đối với mẫu dung dịch bổ sung 10% (w/v) maltodextrin thì hoạt tính thay đổi rất ít và dường như là ổn định nhất so với các mẫu ở cùng điều kiện tồn trữ. Và mẫu không bổ sung maltodextrin thì hoạt tính rất bất ổn. Từ đây có thể suy ra rằng nếu chọn nhiệt độ bảo quản là 40C thì nồng độ maltodextrin bổ sung là 10% (% w/v) thì sẽ cho kết quả tối ưu.
Hình 20: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở -160C, theo nồng độ maltodextrin và thời gian
Mặc khác khi tồn trữ mẫu ở nhiệt độ lạnh đông -160C thì kết quả thể hiện trên hình 20 cho thấy nồng độ maltodextrin bổ sung 20% sẽ giúp hệ enzyme ổn định nhất, hoạt tính có xu hướng tăng dần ở những ngày 3 và 4, do lúc này enzyme đã được sự bảo vệ của maltodextrin nên cấu trúc ít bị biến đổi và có thể duy trì trạng thái gần như ban đầu. Ở nồng độ 30% thì hoạt tính giảm mạnh ở những ngày đầu và đến ngày thứ 4 thì bắt đầu ổn định hơn, tuy nhiên sự biến động hoạt tính của mẫu này lớn hơn rất nhiều so với mẫu bổ sung 20%. Còn đối với mẫu không bổ sung maltodextrin thì hoạt tính luôn có xu hướng giảm dần sau các ngày bảo quản, nguyên nhân là do điều kiện môi trường và các thành phần tạp khác làm giảm hoạt độ của enzyme và có thể gây biến tính enzyme.
Qua những nhận định trên ta thấy rằng việc bảo quản enzyme naringinase thô bằng cách bổ sung maltodextrin không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nhưng với sự có mặt của maltodextrin ở nồng độ xác định, trong những điều kiện nhất định thì cũng phần nào giúp cho hệ enzyme ổn định hơn, duy trì hoạt độ enzyme tốt nhất theo thời gian bảo quản. Điều này có thể được lý giải là do khi bổ sung maltodextrin, lượng maltodextrin này sẽ bao lấy các protein enzyme, ngăn cản sự tiếp xúc giữa chúng giúp hạn chế hiện tượng tự phân, ngoài ra với sự bảo vệ của các phân tử maltodextrin, enzyme sẽ tránh được các tác động của môi trường, và các yếu tố khác gây bất lợi cho enzyme. Đồng thời khi bổ sung maltodextrin thì độ nhớt của dung dịch tăng góp phần giữ ổn định hệ enzyme trong dung dịch, từ đó giúp cho hoạt tính của enzyme ổn định hơn. Tuy nhiên nếu nồng độ maltodextrin quá cao thì sẽ không có hiệu quả vì nó sẽ ngăn cản khă năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất. Bên cạnh đó các phân tử maltodextrin sẽ liên kết lại với nhau và lắng xuống, điều này làm cho độ hoạt động của enzyme sẽ bị giảm.
Bảng 5: Sự biến thiên độ nhớt của dung dịch theo nồng độ maltodextrin bổ sung và thời gian bảo quản Độ nhớt (cP) Thời gian (ngày) Nồng độ (%) Trung bình (thời gian) 0 10 20 30 0 2,165 3,385 5,175 7,185 4,477a 1 2,290 4,075 6,095 8,810 5,193b 2 2,215 4,115 6,140 8,305 5,230b 3 2,255 3,885 6,155 9,060 5,317b 4 2,195 3,890 6,050 8,785 5,328b Trung bình (nồng độ) 2,224 a 3,870b 5,915c 8,429d
Bảng 6: Sự biến thiên độ nhớt của dung dịch theo nồng độ maltodextrin bổ sung và nhiệt độ bảo quản Độ nhớt (cP) Nhiệt độ (0C) Nồng độ (%) Trung bình (nhiệt độ) 0 10 20 30 4 2,260 3,762 5,772 7,930 4,931b -16 2,188 3,978 6,058 8,928 5,288a Trung bình (nồng độ) 2,224 a 3,870b 5,915c 8,429d
Các chữ cái a, b, c,.. trong cùng một cột hoặc một hàng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%.
Kết quảở bảng 5 và 6 cho thấy: có sự khác biệt độ nhớt rất rõ ràng giữa các mẫu, và độ nhớt này tăng theo nồng độ maltodextrin bổ sung. Ngoài ra ở 40C độ nhớt giảm mạnh hơn ở -160C. Do ở nhiệt độ lạnh đông giúp ổn định cấu trúc của các phân tử pectin nên gel bền hơn. Điều này cũng đã lý giải cho sựổn định hoạt độ của enzyme khi bảo quản. Mặc khác độ nhớt từ ngày 1 trở về sau thay đổi rất ít và không có sự khác biệt ý nghĩa, điều này cho thấy hệ dung dịch rất ổn định về trạng thái trong thời gian bảo quản.
Hình 21: Mẫu ban đầu
Hình 22: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có maltodextrin) sau 4 ngày bảo quản ở - 160C
Hình 23: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có maltodextrin) sau 4 ngày bảo quản ở 40C
Xét về sự thay đổi màu sắc, trạng thái của dung dịch mẫu cho thấy theo thời gian bảo quản thì màu sắc thay đổi rõ rệt. Dung dịch mẫu ban đầu có màu vàng đặc trưng, trong suốt và không có mùi lạ. Trong quá trình bảo quản, màu sắc của các mẫu này biến đổi theo chiều hướng có màu trắng đục và sự thay đổi đó tỉ lệ thuận với nồng độ maltodextrin. Kết quả cũng cho ta thấy được ở điều kiện nhiệt độ đông thì màu càng đục hơn so với ở nhiệt độ lạnh. Đối với mẫu không bổ sung maltodextrin thì màu sẽ sậm dần theo thời gian bảo quản. Tuy nhiên các mẫu vẫn chưa có sự xuất hiện của mùi lạ.
4.3 NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CỦA VIỆC KẾT TỦA PROTEIN BẰNG ETHANOL ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME
Các dung môi hữu cơ khi thêm vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, do đó làm thay đổi tính tan của protein và dẫn đến làm kết tủa protein.
Quá trình kết tủa enzyme thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp (khoảng 40C hoặc thấp hơn, tùy yếu tố gây kết tủa), để vừa hạn chế sự biến tính enzyme cũng như tác dụng phân giải của các enzyme proteolytic (Phạm Thị Trân Châu, 2006).
Trước khi thực hiện thí nghiệm, dung dịch enzyme thô được làm lạnh ở 40C, và dung môi hữu cơ cũng được lạnh đông ở -160C. Sau đó, tiến hành kết tủa bằng cồn 700, 850, và 950 (v/v) với tỷ lệ cồn : dung dịch enzyme là 1 : 3. Quá trình kết tủa được thực hiện ở -16ºC trong vòng 4 giờ (Hồ Chí Công, 2010).
Kết tủa được tách ra bằng máy ly tâm (với vận tốc 10000 vòng/phút) trong 20 phút ở 40C. Hòa tan kết tủa thu được với nước cất 40C, thể tích nước cất bằng với thể tích dung dịch enzyme đem kết tủa. Xác định hoạt tính enzyme naringinase sau khi kết tủa.
Bảng 7: Đánh giá hiệu quả của việc kết tủa protein bằng cồn
Các chữ cái a, b, c,.. trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%. Nồng độ cồn (0cồn) Hoạt tính UI/ml Hiệu suất thu hồi (%) 0 12,320a / 70 12,165b 98,74a 85 12,187b 98,93a 95 12,196b 99,00a
11,85 11,90 11,95 12,00 12,05 12,10 12,15 12,20 12,25 12,30 12,35 12,40 12,45 12,50 12,55 0 70 85 95 Nồng độ cồn h o ạ t tí n h ( U I/ m l) Hình 24: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ cồn đến hoạt tính của enzyme naringinase
Các kết quả trong bảng 7 và hình 24 cho thấy hoạt tính enzyme sau kết tủa tăng theo nồng độ cồn. Ở nồng độ cồn 95% thì hoạt tính cao nhất, do nồng độ cồn càng cao thì ái lực của cồn với nước càng lớn, dẫn đến lớp nước liên kết bên ngoài phân tử protein được tách càng nhiều, làm giảm tính tan của protein và dẫn đến kết tủa càng nhiều, do đó hoạt tính càng tăng và hiệu suất thu hồi càng cao. Nhưng khi lượng dung môi tăng quá nhiều sẽ làm biến tính một phần protein nên hoạt tính thu được và hiệu suất thu hồi đều giảm.
Tuy nhiên kết quả không có sự khác biệt ý nghĩa giữa nồng độ cồn 70, 80 và 950. Vì vậy, quá trình kết tủa enzyme naringinase thô ở -160C bằng ethanol, với tỉ lệ ethanol : dung dịch là 1 : 3 sẽ chọn nồng độ cồn sử dụng là 700.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN
Enzyme naringinase sinh tổng hợp từ Aspergillus niger bịảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố bên ngoài lẫn bên trong. Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm hiểu điều kiện bảo quản và phương pháp thích hợp cho quá trình tinh sạch sơ bộ enzyme tốn khá nhiều thời gian và cần đảm bảo chính xác các yếu tố như nhiệt độ, hóa chất sử dụng... Qua quá trình nghiên cứu thu được các kết quả như sau:
+ Ở thí nghiệm 1: kết quả thu được cho thấy việc sử dụng pectin trong quá trình quản, để giúp ổn định hoạt độ enzyme thì không có hiệu quả. Nhưng với nhiệt độ - 160C thì hoạt tính enzyme được giữổn định hơn so với nhiệt độ 40C. Ngoài ra với nhiệt độ -160C, nồng độ pectin bổ sung là 0,1% sẽ giữ cho hoạt tính enzyme ổn định nhất so với các mẫu còn lại.
+ Kết quả khảo sát ở thí nghiệm 2 cho thấy hoạt tính enzyme naringinase thô giữa các mẫu bảo quản ở -160C và 40C, giữa các nồng độ maltodextrin khác nhau thì không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên kết quả cũng chỉ ra rằng bảo quản ở nhiệt độ đông -160C ổn định hơn ở 40C. Với sự có mặt của maltodextrin ở nồng độ xác định, trong những điều kiện nhất định thì cũng phần nào giúp duy trì hoạt độ enzyme tốt nhất theo thời gian bảo quản. Cụ thể ở -160C, nồng độ maltodextrin bổ sung 20% sẽ giúp hệ enzyme ổn định nhất.
+ Đối với quá trình tinh sạch sơ bộ protein bằng ethanol thì hiệu quả đạt được tăng theo nồng độ ethanol sử dụng. Tuy nhiên không có sự khác biệt ý nghĩa giữa cồn 700, 850 và 950. Do đó, ứng với tỉ lệ ethanol : dung dịch là 1 : 3, điều kiện nhiệt độ là -160C thì cồn 700được chọn. Đồng thời hiệu suất thu hồi đạt khá cao.
5.2 ĐỀ NGHỊ
+ Nghiên cứu các phương pháp ức chế hệ enzyme proteolytic nhằm làm giảm tối đa sự phân giải của enzyme trong quá trình bảo quản.
+ Khảo sát một số loại hóa chất khác sử dụng cho quá trình kết tủa enzyme naringinase như acetone, muối ammonium sulfatese, polyethylen glycol (PEG),… + Khảo sát thời gian bảo quản enzyme naringinase sau khi tủa.
+ Nghiên cứu áp dụng các phương pháp bảo quản khác như sấy chân không, sấy thăng hoa, đông khô…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng anh
1. Copeland Robert A. (2000). Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. Wiley-VCH, Inc, 258 pp.
2. Elujoba AA, Hardman R. (1987), Diosgenin production by acid and enzymatic
hydrolysis of fenugreek, Fitoterapia, 58, pp. 299–303.
3. Gabor F, Pittner F. (1984), Characterization of naringinase from Penicillium sp., Hoppe Seyler-Z Physiol Chem, 365, pp. 914- 920.
4. Helder, J., Alfaia, J., Calado, R.T., Maria, H.L. (2006), High pressure- temperature effects on enzymatic activity: Naringin bioconversion, Food Chemistry, pp 1649-1652.
5. Horowitz, R.M., and Gentili, B. (1963), Dihydrochalcone derivatives and their uses as sweeteners, Paten No. 3087826, 3429873.
6. Kaul TN, Middleton E, Ogra PL. (1985), Antiviral effect of flavonoids on
human viruses, J Med Virol, 15, pp. 71-80.
7. Kishi K. (1955), Production of naringinase from Aspergillus niger, Chemistry
and Industry, Japan, 29, pp. 140.
8. Mukherjee, G. and R. Banerjee, (2006). Effects of temperature, pH and
additives on the activity of tannase produced by a co-culture of Rhizopus oryzae and Aspergillus foetidus, World Journal
Microbiology Biotechnology, 22: 207-212.
9. Pandey, A. (1984), Concise encyclopedia of bioresource technology, Institute for Research and Development, France.
10. Parenicová L., (2000). Pectinase of Aspergillus niger: A molecular and
biochemical characterisation.
Doctoral thesis of Wageningen University, ISBN 90-5808-203-2
11. Rosenberg I. M. (2005). Protein analysis and purification: Benchtop techniques. Birkhauser Boston, The United Stated of America.
12. Sarvamangala R. Patil and Agasar Dayanand, (2006). Exploration of regional
agrowastes for the production of pectinase by Aspergillus niger. Food technology,
biotechnology, 44(2), pp 289- 292.
13. Scopes R.K., (1994). Protein purification, principle and practice. Springer. New York Inc.
Tiếng việt
1. Hồ Chí Công (2010). Nghiên cứu trích ly enzyme Bromelain từ vỏ khóm. Luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ thực phẩm. ĐH Cần Thơ.
2. Lê Ngọc Tú (2004). Công nghệ enzyme. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 3. Lương Đức Phẩm (2004). Công nghệ vi sinh vật. NXB Nông nghiệp. Hà Nội. 4. Nguyễn Đức Lượng (2003). Công nghệ sinh học tập 2. NXB Đại học Quốc Gia.
5. Nguyễn Kim Thiên (2010). Sản xuất và ứng dụng enzyme naringinase từ
Aspergillus Niger trong quá trình sản xuất nước bưởi tươi sạch. Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ thực phẩm & đồ uống. ĐH Cần Thơ.
6. Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân (2010). Khảo sát khả năng tinh sạch sơ bộ Pectin methylesterase từ Aspergillus Niger bằng phương pháp kết tủa. Luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ thực phẩm. ĐH Cần Thơ.
7. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006). Công nghệ sinh học tập ba - Enzyme và ứng dụng. NXB Giáo dục. Internet http://www.google.com.vn http://www.thuviengiaoandientu.vn http://www.tailieu.vn http://www.en.wikipedia.org/wiki/bromelain http://sosnick.uchicago.edu/precpsalt.html http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/cong-nghe-san-xuat-pectin.170186.html
y = 0.0035x + 0.0225 R2 = 0.998 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 50 100 150 200 250 Nồng độ naringin (ppm) A b s PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1.1 Xác định hàm lượng naringin bằng phương pháp Davis -1947
Cho 0,1 ml mẫu thử vào ống nghiệm có chứa sẵn dung dịch gồm hỗn hợp 5 ml dietylenglycol 90% và 0,1 ml NaOH 4N. Mẫu trắng được thực hiện tương tự nhưng thay mẫu thử bằng nước cất. Votex mẫu và để yên trong 10 phút. Sau đó, mẫu được đo độ hấp thụở bước sóng 420 nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn có thể suy ra hàm lượng naringin trong mẫu phân tích.
Hình 25: Phương trình đường chuẩn naringin
(Nguồn: Nguyễn Kim Thiên, 2010)
1.2 Xác định hoạt tính của enzyme naringinase bằng phương pháp Davis 1947
Chuẩn bị dung dịch bao gồm 1 ml naringin 0,1% hòa tan trong 0,3 ml dung dịch đệm acetate natri 0,1 M (pH 4,0) và 0,2 ml mẫu thử. Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự nhưng thay mẫu thử bằng nước cất. Mẫu trắng cũng thực hiện tương tự nhưng thay dung dịch naringin 0,1% và mẫu thử bằng nước cất. Hỗn hợp dung dịch này được ủở 500C trong 60 phút. Sau đó lấy 0,1 ml dung dịch hỗn hợp trên cho vào