Sử dụng nấm mốc Aspergillus niger (giống được Trịnh Thị Anh Tâm phân lập và tuyển chọn từ vườn bưởi Năm Roi xã Mỹ Hòa, huyện Bình Minh, Vĩnh Long) cấy vào môi trường thạch nghiêng (PDA) đã tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Ủở 300C trong 3-5 ngày.
Lấy phần vỏ lụa của bưởi năm roi cắt nhỏ, sấy khô (700C, 8 giờ). Sau đó cân 2,5g vỏ lụa sấy khô, cho vào 500ml nước cất, trích ly chất tan trong 1 giờ ở 1000C (5g/l). Dịch trích vỏ lụa sau khi lọc được bổ sung thêm các thành phần như khoáng, đường, pepton... Điều chỉnh pH môi trường về 4,5. Hỗn hợp được đồng nhất bằng máy siêu âm, sau đó cho vào bình tam giác 250 ml (50 ml/bình). Tiếp đến thanh trùng ở 1210C (15 phút), để nguội và chủng nấm mốc Aspergillus niger với mật số khoảng 107, tiến hành lắc mẫu trong thời gian 3 ngày, vận tốc lắc 150 vòng/phút (Nguyễn Kim Thiên, 2010).
Thành phần chủ yếu của môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme naringinase được trình bày trong bảng sau.
Bảng 2: Thành phần chủ yếu của môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger
sinh tổng hợp enzyme naringinase
Thành phần Nồng độ (g/l) NaNO3 2,0 KH2PO4 1,0 KCl 0,5 Na2CO3 0,1 MgSO4.7H2O 0,5 FeCl3 0,15 Pepton 5,0 D-glucose 5,0 Enzyme bromalain 0,1
3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 lần lập lại. Kết quả được tính toán thống kê và vẽ biểu đồ bằng chương trình Stagraphics 4.0, excel.
3.2.3 Phương pháp phân tích mẫu
Xác định hoạt tính enzyme naringinase dựa vào lượng naringin bị thủy phân bằng phương pháp Davis (1947).
Xác định hàm lượng naringin bằng phương pháp Davis (1947). Hàm lượng naringin được đo ở bước sóng 420 nm. Dựa vào Abs đo được và đường chuẩn để xác định hàm lượng naringin. Từđó xác định được hoạt tính enzyme naringinase.
3.3 NỘI DUNG VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu quả của việc bổ sung pectin, khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme
naringinase.
Mục đích: Xác định nồng độ pectin và nhiệt độ bảo quản sao cho hoạt tính enzyme naringinase ổn định nhất.
Chuẩn bị mẫu:
Sinh tổng hợp enzyme naringinase nhưđã nêu ở trên. Hồ hóa pectin trước khi bổ sung vào dung dịch enzyme thô.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nhân tố và lặp lại 2 lần. Nhân tố A: nồng độ pectin bổ sung (% w/v)
A1: 0% A2: 0,1% A3: 0,3% A4: 0,5% Nhân tố B: nhiệt độ bảo quản B1: 40C B2: -160C Nhân tố C: thời gian bảo quản C1: 0 ngày C2: 1 ngày C3: 2 ngày
C4: 3 ngày C5: 4 ngày
Số nghiệm thức: 4 x 2 x 5 = 40 Tổng số mẫu thí nghiệm: 40 x 2 = 80
Chỉ tiêu theo dõi: Xác định hoạt tính enzyme naringinase, kiểm soát pH và theo dõi các biến đổi vật lý.
Ghi nhận kết quả: Xác định hoạt tính naringinase ngay thời điểm đem bảo quản và sau mỗi 24h.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin, nhiệt độ
và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme naringinase.
Mục đích:
Xác định nồng độ maltodextrin bổ sung và nhiệt độ bảo quản sao cho hoạt tính enzyme naringinase ổn định nhất.
Chuẩn bị mẫu: Maltodextrin được hồ hóa trước khi cho vào enzyme thô để bảo quản.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nhân tố và lặp lại 2 lần. Nhân tố D: nồng độ maltodextrin bổ sung (% w/v)
D1: 0% D2: 10% D3: 20% D4: 30% Nhân tố E: nhiệt độ bảo quản E1: 40C E2: -160C Nhân tố F: thời gian bảo quản F1: 0 ngày F2: 1 ngày F3: 2 ngày F4: 3 ngày F5: 4 ngày
Số nghiệm thức: 4 x 2 x 5 = 40 Tổng số mẫu thí nghiệm: 40 x 2 = 80
Chỉ tiêu theo dõi:
Xác định hoạt tính enzyme naringinase, tìm ra nồng độ maltodextrin tối ưu cho qua trình bảo quản. Đồng thời theo dõi các biến đổi vật lý, và sự thay đổi của độ nhớt.
Ghi nhận kết quả:
Xác định hoạt tính naringinase ngay thời điểm đem bảo quản và sau mỗi 24h. Đo độ nhớt dung dịch sau mỗi 24h.
3.3.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu hiệu quả của việc kết tủa protein bằng ethanol (cồn).
Mục đích: Xác định nồng độ C2H5OH thích hợp để thu được kết tủa có độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi cao nhất.
Chuẩn bị mẫu:
Sinh tổng hợp enzyme naringinase nhưđã nêu.
Cồn và dung dịch enzyme được làm lạnh riêng ở nhiệt độ -160C trước khi tiến hành tủa.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 2 lần lặp lại.
Nhân tố G: nồng độ cồn (v/v) bổ sung với tỉ lệ cồn:enzyme là 1:3 G1: 00 G2: 700 G3: 850 G4: 950 Số nghiệm thức: 4 Tổng số thí nghiệm: 4 x 2 = 8
Chỉ tiêu theo dõi:
Xác định nồng độ C2H5OH tối ưu được sử dụng cho quá trình kết tủa. Hiệu suất thu hồi enzyme (%) ứng với từng nồng độ cồn khác nhau.
Ghi nhận kết quả:
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
Nghiên cứu khả năng bảo quản enzyme thô đóng vai trò rất quan trọng trong việc chuẩn bị cho quá trình tinh sạch và ứng dụng tiếp theo. Giống như các enzyme khác, enzyme naringinase rất dễ bị biến đổi hoạt tính do tác động của các điều kiện tự nhiên (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Ở nhiệt độ phòng, sự phá vỡ cấu trúc tế bào dẫn đến biến tính enzyme có thể xảy ra, kết quả là enzyme bị mất hoạt tính. Chính vì thế, nghiên cứu sựổn định hoạt tính của enzyme naringinase thô ở điều kiện nhiệt độ lạnh (4ºC) và lạnh đông (-16ºC) có bổ sung pectin và maltodextrin được tiến hành.
4.1 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA VIỆC BỔ SUNG PECTIN, KHẢO SÁT
ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME
Pectin sau khi hồ hóa sẽđược bổ sung vào dung dịch enzyme thô (% w/v) theo tỉ lệ khảo sát, nồng độ pectin bổ sung là lượng pectin so với dung dịch mẫu chứ không tính lượng nước dùng để hòa tan pectin. Tiến hành bảo quản ở hai nhiệt độ 40C và - 160C, sau các khoảng thời gian dự kiến, mẫu được đem phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Davis - 1947. Sự thay đổi hoạt tính của enzyme được thể hiện ở bảng 3.
Bảng 3: Sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase theo nồng độ pectin và nhiệt độ
bảo quản Hoạt tính UI Nồng độ pectin (%) Nhiệt độ (oC) 0 0,1 0,3 0,5 Trung bình (nhiệt độ) 4 12,150 12,054 12,135 12,059 12,106a -16 12,119 12,195 12,186 12,118 12,148a Trung bình (nồng độ) 12,135 a 12,124a 12,161a 12,089a
Các chữ cái a, b, c,.. trong cùng một cột hoặc một hàng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%.
Từ kết quả ở bảng 3 cho thấy các mẫu enzyme được bảo quản ở nhiệt độ 40C và - 160C thì sự thay đổi hoạt tính không khác nhau. Đồng thời, không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các mẫu khi bổ sung pectin.
10,00 10,50 11,00 11,50 12,00 12,50 13,00 13,50 0 1 2 3 4 5 Ngày bảo quản H o ạ t tí n h ( U I/ m l) 0% 0,1% 0,3% 0,5% hàm các hoạt động vi sinh hoặc quá trình tự phân của enzyme nhờ lạnh đông. Ở điều kiện lạnh đông -160C, nước kết tinh, lượng nước tự do trong dung dịch chứa enzyme giảm. Hệ quả là độ hoạt động của nước trong dung dịch giảm thấp, hầu hết các phản ứng hóa học, và biến đổi vật lý sẽ bị kìm hãm. Vì thế, sau rã đông, dung dịch có thể duy trì được trạng thái gần như ban đầu và đặc tính của các phần tử trong dung dịch được giữ ổn định (Copeland, 2000). Tuy vậy, điều kiện lạnh đông chỉ có thể kìm hãm một số vi sinh vật và các yếu tố ảnh hưởng khác nhưng không ngăn chặn hoàn toàn được nên hoạt tính enzyme vẫn giảm dần trong các ngày bảo quản tiếp theo.
Các nghiên cứu về sự ổn định của enzyme cũng cho thấy, lạnh đông nhanh ở nhiệt độ nhỏ hơn -200C (tốt nhất là -700C hay lạnh đông bằng Nitơ lỏng) là chếđộ tối ưu nhằm duy trì hoạt tính của enzyme (Copeland, 2000).
Hình 14: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở 40C, theo nồng độ pectin và thời gian bảo quản
Ở 40C pectin hầu như không có tác dụng giữổn định hoạt tính enzyme. Kết quả cho thấy hoạt tính enzyme giảm ở ngày 1 và bắt đầu tăng nhẹ từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4. Điều này có thể hiểu là do ở nhiệt độ thấp, khả năng kết hợp giữa protease và enzyme không tồn tại, vì vậy hoạt tính enzyme tăng lên.
10,00 10,50 11,00 11,50 12,00 12,50 13,00 13,50 0 1 2 3 4 5 Ngày bảo quản H o ạ t tí n h ( U I/ m l) 0% 0,1% 0,3% 0,5%
Hình 15: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở -160C, theo nồng độ pectin và thời gian bảo quản
Ta nhận thấy nồng độ pectin bổ sung 0,1% tồn trữ ở -160C giúp hoạt tính enzyme ổn định nhất qua các ngày bảo quản, do pectin có các nhóm hydroxyl (-OH) nên có khả năng hydrate hóa cao. Mặc khác, các phân tử pectin mang điện tích âm nên chúng có khả năng đẩy lẫn nhau, do đó làm giản mạch và làm tăng độ nhớt của dung dịch. Vì vậy khi làm giảm độ tích điện và độ hydrate hóa sẽ làm cho các phân tử pectin xích lại gần nhau và tương tác với nhau tạo nên một mạng lưới 3 chiều rắn, chứa pha lỏng ở bên trong, và điều đó giúp cho enzyme ổn định hơn khi bảo quản. Nhưng nếu hàm lượng pectin cao thì sự liên hợp giữa các phân tử xảy ra càng nhanh, hệ keo càng bền, vì vậy enzyme khó tiếp xúc được với cơ chất, dẫn đến hoạt tính không ổn định.
Từ hai đồ thị trên ta thấy hoạt tính enzyme giảm nhanh ở ngày 1 sau đó lại tăng trở lại và tăng mạnh ở ngày thứ tư. Điều đó có nghĩa là enzyme duy trì được trạng thái ban đầu và đặc tính của các phân tử trong dung dịch được giữổn định nhất từ ngày bảo quản thứ tư. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu bảo quản enzyme thô của Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân (2010).
Hình 16: Dung dịch mẫu trước khi bảo quản
Hình 17: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có pectin) bảo quản ở 40C sau thời gian 4 ngày
Hình 18: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có pectin) bảo quản ở -160C sau thời gian 4 ngày
Sau bốn ngày bảo quản sự thay đổi màu sắc diễn ra khá rõ rệt. Dung dịch enzyme naringinase thô ban đầu có màu vàng đặc trưng , trong suốt và không có mùi lạ. Tuy nhiên theo thời gian thì màu vàng này trở nên sậm và ngã sang màu vàng nâu. Sự thay đổi này thể hiện rõ ở nhiệt độ 40C, còn ở nhiệt độ -160C thì sự chuyển màu này xảy ra ít hơn. Do ở nhiệt độ lạnh thì các phản ứng hóa học cũng như vi sinh xảy ra mạnh hơn ở điều kiện nhiệt độ đông. Tuy nhiên trạng thái của các mẫu không có sự thay đổi đáng kể.
Qua kết quả thu được có thể rút ra kết luận sau: nên sử dụng dung dịch enzyme thô sau khi để ổn định từ hai đến ba ngày trong điều kiện nhiệt độ lạnh đông. Việc sử
dụng pectin trong quá trình bảo quản, để giúp ổn định hoạt độ enzyme thì không có hiệu quả. Tuy nhiên ở -160C, nồng độ pectin bổ sung là 0,1% thì hoạt tính enzyme ổn định hơn so với các mẫu còn lại. Ngoài ra ở điều kiện lạnh đông thì sự thay đổi tính chất vật lý ít hơn.
4.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MALTODEXTRIN, NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NARINGINASE THÔ
Dung dịch enzyme naringinase thô sau khi sinh tổng hợp sẽ được bổ sung maltodextrin đã hồ hóa vào (% w/v) theo các tỉ lệ khảo sát. Và maltodextrin bổ sung chính là lượng maltodextrin so với khối lượng dung dịch mẫu đem bảo quản, không tính lượng nước dùng để hòa tan. Tiến hành bảo quản ở hai nhiệt độ 40C và -160C. Sau các khoảng thời gian dự kiến, mẫu được đem phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Davis – 1947.
Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin và nhiệt độ bảo quản đến hoạt tính enzyme naringinase Hoạt tính (UI/ml) Nồng độ maltodextrin (%) Nhiệt độ (oC) 0 10 20 30 Trung bình (nhiệt độ) 4 12,040 12,007 11,925 11,844 11,954a -16 11,949 11,976 11,985 11,909 11,955a Trung bình (nồng độ) 11,995 a 11,991a 11,955a 11,876b
Các chữ cái a, b, c,.. trong cùng một cột hoặc một hàng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%.
Kết quả cho thấy hoạt tính enzyme naringinase thô bảo quản ở -160C và 40C không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên kết quả cũng chỉ ra rằng bảo quản ở nhiệt độđông -160C ổn định hơn ở 40C. Nguyên nhân là do ởđiều kiện lạnh đông, các hoạt động sinh hóa, vi sinh của hợp chất bị kìm hãm, đồng thời sự biến tính của enzyme cũng như tác dụng phân giải của các enzyme proteolytic có mặt trong dịch chiết bị hạn chế. Đồng thời cấu trúc của maltodextrin ít thay đổi, giúp bảo vệ enzyme tốt hơn.
10,00 10,50 11,00 11,50 12,00 12,50 13,00 0 1 2 3 4 5 Ngày bảo quản H o ạ t tí n h ( U I/ m l) 0% 10% 20% 30% 10,00 10,50 11,00 11,50 12,00 12,50 13,00 0 1 2 3 4 5 Ngày bảo quản H o ạ t tí n h ( U I/ m l) 0% 10% 20% 30%
Hình 19: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở 40C, theo nồng độ maltodextrin và thời gian
Từ kết quả ở hình 19 cho thấy khi tồn trữở nhiệt độ lạnh 40C, hoạt tính enzyme có xu hướng giảm trong 2 ngày đầu tiên và sau đó hệ enzyme ổn định nên hoạt tính bắt đầu tăng lên. Riêng đối với mẫu dung dịch bổ sung 10% (w/v) maltodextrin thì hoạt tính thay đổi rất ít và dường như là ổn định nhất so với các mẫu ở cùng điều kiện tồn trữ. Và mẫu không bổ sung maltodextrin thì hoạt tính rất bất ổn. Từ đây có thể suy ra rằng nếu chọn nhiệt độ bảo quản là 40C thì nồng độ maltodextrin bổ sung là 10% (% w/v) thì sẽ cho kết quả tối ưu.
Hình 20: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở -160C, theo nồng độ maltodextrin và thời gian
Mặc khác khi tồn trữ mẫu ở nhiệt độ lạnh đông -160C thì kết quả thể hiện trên hình 20 cho thấy nồng độ maltodextrin bổ sung 20% sẽ giúp hệ enzyme ổn định nhất, hoạt tính có xu hướng tăng dần ở những ngày 3 và 4, do lúc này enzyme đã được sự bảo vệ của maltodextrin nên cấu trúc ít bị biến đổi và có thể duy trì trạng thái gần như ban đầu. Ở nồng độ 30% thì hoạt tính giảm mạnh ở những ngày đầu và đến ngày thứ 4 thì bắt đầu ổn định hơn, tuy nhiên sự biến động hoạt tính của mẫu này lớn hơn rất nhiều so với mẫu bổ sung 20%. Còn đối với mẫu không bổ sung maltodextrin thì hoạt tính luôn có xu hướng giảm dần sau các ngày bảo quản, nguyên nhân là do điều kiện môi trường và các thành phần tạp khác làm giảm hoạt độ của enzyme và có thể gây biến tính enzyme.
Qua những nhận định trên ta thấy rằng việc bảo quản enzyme naringinase thô bằng cách bổ sung maltodextrin không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nhưng với sự có mặt của maltodextrin ở nồng độ xác định, trong những điều kiện nhất định thì cũng phần nào giúp cho hệ enzyme ổn định hơn, duy trì hoạt độ enzyme tốt nhất theo thời gian bảo quản. Điều này có thể được lý giải là do khi bổ sung maltodextrin, lượng maltodextrin này sẽ bao lấy các protein enzyme, ngăn cản sự tiếp xúc giữa chúng