L ỜI CẢM ƠN
2.2.2 Động học của quá trình lên men
Tốc độ của quá trình lên men có thể xác định trực tiếp bằng lượng đường được lên men, hoặc gián tiếp xác định lượng rượu tạo thành và lượng CO2 thoát ra trong một đơn vị thời gian. Cũng có thể xác định nhanh tốc độ lên men bằng cách đo nồng độ biểu kiến của dịch lên men.
Để theo dõi quá trình lên men được rõ ràng, Lêbêđép đã dùng tỉ lệ men giống rất ít, theo dõi lượng đường giảm trong từng giờ và biểu diễn theo phần trăm so với tổng lượng đường có trong dịch lên men (hình 2.13).
Hình 2.13 Đường biểu diễn lên men (theo Lêbêđép)
(Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007)
Theo hình 2.13, ta nhận thấy lên men được chia thành 3 giai đoạn: lên men sơ bộ, lên men chính và lên men phụ.
Trong giai đoạn đầu, thời gian kéo dài 60 giờ đặc trưng cho thời kì tiềm phát, lượng đường được lên men rất ít. Giai đoạn hai kéo dài khoảng từ giờ thứ 60 đến giờ thứ 120, sinh trưởng của nấm men và lên men tăng nhanh, đạt tới cực đại – đặc trưng cho thời kỳ lên men chính. Giai đoạn ba đặc trưng cho lên men phụ kéo dài, tốc độ lên men rất chậm vì lượng đường trong dịch còn rất ít, các dextrin chưa kịp biến thành đường (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
2.2.3 Các sản phẩm phụ của quá trình lên men
Theo Lương Đức Phẩm (2005), những chất do nấm men tạo ra trong quá trình sống và được giải phóng vào môi trường. Một số chất này là sản phẩm trao đổi chất của nấm men rất đáng được quan tâm đối với rượu vang.
Trong lên men có hai sản phẩm chính là rượu ethylic và CO2. Ngoài ra còn là các sản phẩm là các chất thứ cấp hay là các sản phẩm bậc hai. Các sản phẩm được tạo thành từ protein cũng như từ các acid amin với các chất phân giải trung gian của đường tạo thành là các loại rượu bậc cao. Ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác.
Glycerin: được tạo thành trong lên men khi acetaldehyde liên kết với bisulfit natri hoặc lên men ở môi trường kiềm. Glycerin được tạo thành mạnh mẽ từ khi bắt đầu lên men. Nhờ có vị ngọt và sánh như dầu, glycerin đóng vai trò nhất định trong sự làm hài hòa vị của vang. Hàm lượng glycerin trong vang thường là 7 ÷ 14 g/l. Sự khác nhau về hàm lượng chất này có trong vang phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ lên men, mức độ sulfite hóa và đặc biệt là vào từng chủng nấm men dùng trong sản xuất.
Acetone và diacetyl: đều có ảnh hưởng đến chất lượng của vang, mặc dù số lượng của chúng được tạo ra trong vang không lớn lắm: acetoin từ 2,0 ÷ 84 mg/l và diacetyl từ 0,1 ÷ 1,8 mg/l. Sự có mặt của chúng ở trong vang có hai khả năng: ảnh hưởng rất lớn đến hương vị vang và biến đổi hóa sinh. Diacetyl ở nồng độ thấp cho vang mùi xác định, nhưng lớn hơn 1 mg/l sẽ cho vang tông mùi vị chua oxy hóa, thỉnh thoảng chuyển sang mùi chuột. Sự tạo thành diacetyl và acetoin trong lên men có quan hệ tương tác với sulfite hóa dịch quả. Trong quá trình lên men, đặc biệt ởđiều kiện hiếu khí, số lượng diacetyl tăng lên, song sự tích tụ của nó không tương đồng với sự tạo thành acetoin. Vào cuối lên men, diacetyl dễ bị khử thành acetoin và acetoin lại được khử thành 2,3- butylenglycol. Số lượng các chất này phụ thuộc vào nồng độ đường ban đầu, nồng độ càng cao càng tích tụ nhiều diacetyl và cũng tùy thuộc vào chủng nấm men.
Aldehyde: Bao gồm các chất như aldehyde acetic, propionic, butyric, valeric, enantic,…Các aldehyde này có mùi rất gắt (khi chưa pha loãng), trừ aldehyde acetic, khi pha loãng các aldehyde khác đều có mùi dễ chịu của tông mùi quả tự nhiên. Đặc biệt khi sulfite hóa dịch quả sẽ tạo ra nhiều acetaldehyde hơn. Khi SO2 tạo thành trong dịch lên men sẽ bị giảm dần do bị phân hủy và tích tụ acetaldehyde trong vang. Khi men rượu vang có oxy sẽ oxy hóa ethanol thành aldehyde acetic (acetaldehyde) tương ứng. Nấm men có thể tiêu hao 4% tổng lượng rượu để sinh ra acetaldehyde.
Các acid hữu cơ: các acid bay hơi thường gặp trong vang là: acid acetic, propionic, isobutyric, butyric, isovaleric, capronic, caprilic, valeric. Các acid bay hơi chỉ tích tụ trong giai đoạn đầu lên men. Một số nấm men dùng acid acetic làm cơ chất dinh dưỡng và như vậy trong quá trình lên men acid bay hơi tạo thành trong giai đoạn đầu và giảm dần trong giai đoạn cuối (do nấm men sử dụng).
Acid succinic trong vang chỉ khoảng 0,1 ÷ 0,4%.
Acid lactic thường xuyên có mặt trong quá trình lên men rượu vang, khoảng 5% đường tiêu hao cho tổng hợp acid này. Hàm lượng trong rượu vang khoảng 2,5 ÷ 4,5 g/l.
Acid citric chỉ ở một lượng không đáng kể 0,3 ÷ 0,8 g/l. Acid này thường phổ biến trong các loại quả.
Acid malic trong dịch quả tới 3,0 ÷ 4,5 g/l, nhưng khi nấm men sử dụng acid này thì hàm lượng của nó bị giảm tới 25%. Acid này làm cho vang có vị chua gắt.
Các cetoacid trong vang là đại diện cho acid pyruvic, axaloacetic, α – cetoglutaric,…Hàm lượng acid pyruvic trong vang ở khoảng 11 ÷ 460 mg/l, α – cetoglutaric khoảng 2 ÷ 341 mg/l. Lên men ở điều kiện dư áp suất thì hàm lượng acid pyruvic giảm, nhưng α – cetoglutaric lại tăng lên.
Các este: là các hợp chất quan trọng hình thành hương vị cho vang. Trong số những este hình thành trong quá trình lên men thì ethylacetate là vượt trội hơn cả về số lượng, nó có mùi của quả tự nhiên. Sự tạo thành este cũng tùy thuộc vào loài và giống nấm men sử dụng. Ngưỡng cảm nhận ethylacetate có trong vang là 180 ÷ 200 mg/l. Nếu cao hơn hoặc thấp hơn sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới vị của vang, cao quá thì gây vị đắng, khó chịu.
Một số nấm men khi sinh trưởng, chẳng hạn như S. cerevisiae, trong điều kiện kỵ khí cần các acid oleic, linoleic, linolenic. Việc này tạo ra các este etylic của các acid béo bậc cao sẽ làm cho mùi vị vang thêm mềm mại, dịu êm và hài hòa hơn.
Lipid: là hỗn hợp các chất béo thực (este của acid béo với glycerin), sáp (este của acid béo với rượu bậc cao), phospholipid (chứa acid béo, glycerin, phosphate vô cơ và amin hoặc acid amin).
Tế bào S. cerevisiae có khả năng tích tụ các chất béo này trong tế bào từ 12,6 ÷ 42,8% so với chất khô.
quá trình lên men rượu. Rượu bậc cao cũng được tạo thành do kết quả chuyển hóa của các hydratcacbon trong khi lên men.
Rượu bậc cao là sản phẩm được tổng hợp ở ranh giới trao đổi chất cacbon và nitơ của nấm men.
Trong vang ta thấy có các rượu sau: methnol, n-propanol, isopropanol, n- butanol, isobutanol, n-pentanol (rượu amylic), 2-metylbutanol, 3- metylbutanol (rượu isoamylic), n-hexanol, rượu β-phenyletylic, triptofol. Hàm lượng các rượu này trong vang phụ thuộc vào điều kiện lên men.
Khi lên men trong điều kiện lên men dư oxy thì hàm lượng các rượu bậc cao tạo ra lớn hơn trong điều kiện kỵ khí và dưới áp lực CO2. Nhưng lên men dưới áp lực CO2 sẽ giảm được hàm lượng rượu bậc cao, đặc biệt là isoamylic, amylic. Hai rượu này ảnh hưởng xấu đến mùi vị của vang, chúng chiếm tới 90% tất cả các rượu bậc cao có trong vang. Các rượu bậc cao mạch vòng như β- phenyletylic, tiozol, triptophol có tác dụng làm cho vị vang êm dịu hơn nhưng hàm lượng không được vượt quá 20 ÷ 25 mg/l.
Sulfuahydryl (–SH): hợp chất có chứa nhóm –SH có thểđược nấm men tiết vào môi trường trong quá trình lên men. Chất này làm giảm thế oxy hóa – khử (Eh), một chỉ số quan trọng trong suốt quá trình lên men và tàng trữ vang cho đến chín sinh học của sản phẩm.
Sulfuahydro (H2S): có mùi khó chịu và có ở trong vang với hàm lượng vượt quá 0,005 mg/l làm giảm chất lượng rượu vang. Tạo ra H2S trong lên men thuộc vào từng chủng nấm men sử dụng, vào nhiệt độ và môi trường. Nấm men có thể chuyển hóa S và SO2 thành H2S. Cystine, acid asparatic, glutamic, glyxerin, histidine, ornitine, serine, treonine kích thích sự tạo thành H2S. Mỗi chủng nấm men tạo ra H2S khác nhau tùy thuộc vào đặc tính di truyền. Để giảm hàm lượng H2S, ta dùng hỗn hợp các chủng nấm men có và không có khả năng khử sulfite trong lên men.
2.2.4 Các yếu tố hóa học và lý học ảnh hưởng tới quá trình lên men
2.2.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nấm men khá bền vững trong nhiệt độ thấp, nó có thể sống trong băng nhiều tháng, thậm chí ở nhiệt độ -190oC. Nhưng nó rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, trong môi trường lỏng ở nhiệt độ 40 ÷ 50oC nấm men hầu như ngưng trệ hoạt động và sau 1h30’ sẽ bị chết, ở nhiệt độ 60 ÷ 65oC chúng sẽ bị chết sau 5 phút. Nhưng trong môi trường khô hơn (W = 13%) chúng chịu nhiệt tốt hơn, thậm chí lên tới 85 ÷ 105oC (Bùi Ái, 2003).
Lên men vang thường được thực hiện ở nhiệt độ 10 ÷ 30oC, ở nhiệt độ lên men cao thì lên men bắt đầu sớm, nhưng dễ bị dừng lại ngang chừng và kết thúc lên men khi đường sót còn lại ở dịch lên men là khá lớn và đường này sẽ là nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic hoạt động, có ảnh hưởng không tốt đến rượu vang (Lương Đức Phẩm, 2006). Nhiệt độ tối ưu cho nấm men vang là 25 ÷ 28oC (Bùi Ái, 2003). Riêng đối với loài Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 28 ÷ 32oC (hình 2.14) (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007). Ở nhiệt độ thấp hơn, nấm men hoạt động chậm và yếu hơn. Vì vậy lượng đường còn lại trong môi trường lên men khá lớn, và đây chính là môi trường tốt cho những vi sinh vật gây bệnh rượu vang hoạt động (Bùi Ái, 2003). Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men cao và kéo dài hơn. Mặt khác nếu có điều kiện làm lạnh dịch lên men 20 ÷ 22oC sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm lactic và nấm men dại. Ở nhiệt độ 30oC, nấm men dại phát triển nhanh hơn saccharomyces 2 đến 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 ÷ 38oC chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần. Lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo ra nhiều este aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
Nói chung, nhiệt độ lên men cao ở khoảng 30 ÷ 35oC sự bắt đầu tích tụ rượu ethylic càng sớm, tốc độ lên men nhanh và kết thúc sớm, nhưng không lên men được hết đường (đường sót còn lại với một lượng khá lớn). Điều này có thể nguy hiểm, vì đường sót sẽ được vi khuẩn lactic sử dụng để tạo thành acid lactic, làm chua dịch lên men, làm ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm. Lên men ở nhiệt độ cao sẽ làm cho các vi khuẩn tạp nhiễm phát triển nhanh, gây cho sản phẩm nhiều biến đổi xấu về chất lượng.
Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến cường độ lên men và sinh trưởng của nấm men mà còn ảnh hưởng tới sinh tổng hợp các sản phẩm phụ và thứ cấp. Nhiệt độ càng cao càng dễ sinh và tích tụ các sản phẩm loại này. Điều này không có lợi cho chất lượng của sản phẩm chính.
Nhiệt độ lên men cao dẫn đến tích tụ nhiều loại rượu bậc cao cũng như acetaldehyde. Nhiệt độ lên men tăng từ 10 ÷ 25oC kéo theo tăng hàm lượng acetaldehyde từ 1,25 lên 21,5 mg/l.
Hoạt tính của nấm men bị giảm khi nhiệt độ xuống thấp. Cường độ hô hấp của nấm men ở 50C có thể chỉ bằng 1/5 so với ở nhiệt độ 30oC. Thông thường trong lên men vang, người ta lên men ở nhiệt độ 20 ÷ 25oC ở lên men chính và 10 ÷ 15oC trong lên men phụ sẽ cho sản phẩm có chất lượng tốt (Lương Đức Phẩm,
Hình 2.14 Ảnh hưởng của nhiệt độđến sự phát triển của nấm men và tạp khuẩn
(Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007)
Nhiệt độ có thể tăng lên 36oC mà nấm men vẫn hoạt động bình thường nhưng cao hơn sẽức chế nấm men và có thể bị chết. Các vi khuẩn sinh acid acetic hoạt động khi to≥ 40oC. Do đó, việc kiểm soát nhiệt độ là một trong những tác nhân quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng vang (Bùi Ái, 2003).
2.2.4.2 Ảnh hưởng của pH
Nồng độ ion H+ trong dịch lên men có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, trạng thái này lại phụ thuộc vào pH của canh trường (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
Độ pH của dịch quả nằm trong khoảng 2,8 ÷ 3,8. Loài S. cerevisiae và S.
carlsbergensis chịu được pH cao hơn 3,5 (Lương Đức Phẩm, 2006). Trong quá trình lên men pH giảm xuống rồi lại tăng dần lên, nguyên nhân giảm pH hay là tăng độ chua của môi trường được giải thích bằng sự tạo thành CO2 và các acid hữu cơ hình thành trong quá trình lên men (Lương Đức Phẩm, 2005). Nấm men vang bảo vệ được hoạt tính ở 10 ÷ 20 g/l acid tự do (acid tartaric, acid malic, acid citric). Chúng có thể hoạt động tốt trong môi trường có 8 ÷ 10 g/l acid (với môi trường này thì hầu như vi khuẩn bị ức chế), đặc biệt là vi khuẩn acetic hoạt động tốt ở pH 3,5 ÷ 4,5, với các loài vi khuẩn khác là 7. Vì vậy, môi trường
dịch lên men càng chua thì càng hạn chế được hoạt động của nhiều loại vi khuẩn (Bùi Ái, 2003).
Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo ethanol là 4,5 ÷ 5,0. Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, glycerin tạo ra nhiều và do đó làm giảm hiệu suất lên men. Ở pH ≤ 4,2 nấm men phát triển tuy chậm hơn so với ở pH 4,5 ÷ 5,0 (hình
2.15), nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển. Tới lúc nào đó nấm men đã phát triển được nhiều và đủ mạnh, ta tăng pH đến tối ưu cho nấm men phát triển nhanh hơn. Lúc này điều kiện tốt hơn cho tạp khuẩn nhưng vì nấm men đã nhiều và đủ mạnh để lấn át nên tạp khuẩn cũng khó gây tác hại cho nấm men.
Hình 2.15 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm men và tạp khuẩn
(Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007)
Đối với một dung dịch nào đó thì pH có thể xem gần nhưổn định, còn độ chua thì lại thay đổi nhiều – phụ thuộc vào mức độ nhiễm khuẩn và nguyên liệu của dịch lên men. Khi nhiễm khuẩn sẽ tạo acid hữu cơ có độ phân ly thấp nên ít làm thay đổi pH. Vì vậy, trong sản xuất rượu vang không chỉ xác định pH mà luôn kèm theo xác định độ chua (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
2.2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men
Nồng độ đường quá cao sẽ dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007). Giới hạn áp suất thẩm thấu đối với sinh trưởng và lên men đường của
áp suất thẩm thấu cao có thể từ 62 (S.mellis và S.geterogenicus) tới 23 MPa
(S.rosei), các loài không chịu được áp suất thẩm thấu cao từ 16 (S.cerevisiae)
đến 12 MPa (S. carlsbergensis) (Lương Đức Phẩm, 2006). Quá trình lên men vang xảy ra nhanh, thuận lợi khi:
- Trong dịch lên men có hàm lượng đường từ 10 ÷ 25%, quá trình lên men vẫn bình thường.
- Trong dịch lên men có hàm lượng đường từ > 25%, quá trình lên men bắt đầu chậm, khó khăn.
- Trong dịch lên men có hàm lượng đường chiếm 35% thì quá trình lên men xảy ra rất yếu và chậm chạp (Bùi Ái, 2003).
2.2.4.4 Ảnh hưởng của chất sát trùng
Trong sản xuất rượu vang các chất sát khuẩn được dùng để giữ dịch quả và vang thành phẩm.
SO2 được dùng nhiều trong sản xuất rượu vang. Nó có tác dụng sát khuẩn tốt nhất cho vang và có hoạt tính antioxidation (chất chống oxy hóa) làm tê liệt oxydase, trong đó có polyphenoloxydase. Trong dịch quả hoặc vang, nó ở dạng