Kết quả so sánh hiệu quả tinh sạch enzyme cellulase tương ứng với với 2 phương pháp kết tủa protein dựa trên 2 giá trị tối ưu thu được từ nghiệm thức khảo sát được tổng hợp ở bảng 4.
Bảng 4: Kết quả so sánh hai phương pháp kết tủa khác nhau Tác nhân gây tủa Tỷ lệ (hoặc nồng độ) hóa chất và enzyme thô Khối lượng kết tủa (g) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh sạch (lần) Đối chứng - - 0,024a 100c 1,00a (NH4)2SO4 55% bão hòa 7,753 0,100b 41,596a 4,180b Ethanol 3:1 (v/v) 5,052 0,110c 46,414b 4,593c
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%
Từ số liệu ở bảng trên, ta thấy hiệu quả tinh sạch sơ bộ enzyme cellulase bằng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 55% đạt hiệu quả thấp hơn so với biện pháp cho kết tủa với ethanol ở tỷ lệ ethanol : enzyme là 3 : 1. Tuy nhiên, kết quả thu được giữa 2 biện pháp tinh sạch sơ bộ cũng không khác nhau nhiều về hoạt tính riêng và độ tinh sạch khi tủa với muối ammonium sulfate là 0,100 U/mgprotein và 4,18 lần còn hoạt tính riêng và độ tinh sạch khi tủa bằng ethanol là 0,110 U/mgprotein và 4,593 lần. Bên cạnh đó, ta thấy được hoạt tính riêng và độ tinh sạch của enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ thu được không cao. Nguyên nhân là ngoài enzyme cellulase trong hệ ezyme thô thì còn có một số loại ezyme khác có khả năng làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase. Vì thế mà cần phải có biện pháp kìm hãm hoặc loại bỏ sự hoạt
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 23
4.4 Ảnh hưởng của thờ gian bảo quản đến sựổn định của enzyme cellulase sau khi tinh sạch sơ bộ
4.4.1 Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản kết tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản
Việc nghiên cứu khả năng bảo quản của enzyme sau khi tinh sạch đóng vai trò quan trọng cho các bước tinh sạch cao hơn và sử dụng tiếp theo. Giống như các enzyme khác, enzyme cellulase cũng dễ bị mất hoạt tính khi bảo quản ở nhệt độ thường nên việc bảo quản các loại enzyme thường tiến hành ở nhiệt độ thấp.
Các mẫu enzyme sau khi kết tủa, cân khối lượng sẽ được cho vào bảo quản ở nhiệt
độ -20oC và được đo hoạt tính sau mỗi 7 ngày. Kết quả khảo sát được trình bày ở
bảng 5.
Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản
Điều kiện bảo quản Thời gian bảo quản (tuần) Hoạt tính riêng (U/mg protein) 0 0,065d 1 0,060cd Lạnh đông (-200C) 2 0,055bc 3 0,052ab 4 0,046a
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%
Từ bảng kết quả tổng hợp trên, cho thấy hoạt tính riêng của enzyme cellulase sau khi tinh sạch sơ bộ bằng muối ammonium sulfate giảm dần theo thời gian bảo quản
ởđiều kiện lạnh đông (nhiệt độ -20oC), tuy nhiên sự giảm hoạt tính riêng này không nhiều. Tuần đầu tiên, hoạt tính riêng đo được là 0,065 U/mgprotein thì đến tuần thứ 4 hoạt tính giảm còn 0,046 U/mgprotein (giảm khoảng 1,4 lần). Nhiệt độ lạnh đông thường được chọn để bảo quản enzyme vì lượng nước tự do trong hỗn hợp kết tủa giảm kéo theo độ hoạt động của nước giảm nên hầu hết các các phản ứng hóa học, sinh hóa sẽ bị kìm hãm. Tuy nhiên, điều kiện lạnh đông chỉ có thể kìm hãm một số
phản ứng sinh hóa hay các yếu tố ảnh hưởng khác nhưng không ngăn chặn được hoàn toàn nên hoạt tính của enzyme giảm dần trong các tuần bảo quản tiếp theo.
4.4.2 Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ethanol theo thời gian bảo quản kết tủa với ethanol theo thời gian bảo quản
Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính của enzyme cellulase sau khi được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol được trình bày ở bảng 6.
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 24
Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ethanol theo thời gian bảo quản
Điều kiện bảo quản Thời gian bảo quản (tuần) Hoạt tính riêng (U/mg protein) 0 0,070b 1 0,066ab Lạnh đông (-200C) 2 0,061ab 3 0,060ab 4 0,055a
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%
Ở trường hợp này, hoạt tính riêng có giảm nhưng không đáng kể. Sau 4 tuần bảo quản hoạt tính riêng giảm từ 0,070 U/mgprotein xuống 0,055 U/mgprotein (giảm khoảng 1,27 lần).
So với trường hợp bảo quản lạnh đông enzyme cellulase sau khi tinh sạch sơ bộ
bằng (NH4)2SO4 thì trường hợp bảo quản lạnh đông enzyme cellulase sau khi tinh sạch sơ bộ bằng ethanol có hoạt tính riêng thay đổi ít hơn. Nhưng sự thay đổi này là không đáng kể, từ tuần đầu tiên đến tuần thứ 3 sau khi bảo quản, sự thay đổi không có ý nghĩa về mặt thống kê, đến tuần thứ tư, hoạt tính enzyme giảm có sự khác biệt so với tuần đầu tiên.
Như vậy, khi so sánh khả năng tinh sạch sơ bộ enzyme cellulase thô, enzyme thu
được bằng phương pháp kết tủa với dung môi ethanol lạnh cho hoạt tính riêng cao hơn; đồng thời enzyme giảm hoạt tính ít hơn so với cellulase thu được bằng kết tủa với muối ammonium sulfate.
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 25
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Việc nghiên cứu về khả năng tinh sạch sơ bộ và bảo quản enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ có ý nghĩa rất quan trọng cho các các quá trình tinh sạch và sử dụng tiếp theo. Enzyme cellulase rất nhạy cảm với các yếu tố môi trường bên ngoài lẫn bên trong, việc nghiên cứu cần phải đảm bảo chính xác các yếu tố như: nhiệt độ, hóa chất, dụng cụ, thao tác,... Kết quả khảo sát cho thấy:
Qua so sánh hai biện pháp tinh sạch sơ bộ bằng muối (NH4)2SO4 và ethanol thì muối ammonium sulfate cho hiệu quả kết tủa thấp hơn so với kết tủa bằng cồn. Với hoạt tính riêng, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch thu được lần lượt là 0,100 U/mgprotein , 41,596%, 4,180 lần (ứng với (NH4)2SO4 55% bão hòa) và 0,110 U/mgprotein, 46,414%, 4,593 lần (khi tủa với tỉ lệ 3 V ethanol: 1 V dịch enzyme thô). Khi bảo quản ở nhiệt độ lạnh đông -20oC, enzyme đã được tinh sạch sơ bộ bằng hai loại hóa chất cho kết quả không khác nhau nhiều sau 4 tuần bảo quản. Hoạt tính của enzyme được tinh sạch sơ bộ bằng muối ammonium sulfate giảm khoảng 1,4 lần sau 4 tuần bảo quản (hoạt tính riêng giảm từ 0,065 U/mgprotein xuống còn 0,046 U/mgprotein), enzyme được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol thì hoạt tính riêng giảm 1,27 lần sau 4 tuần (hoạt tính riêng giảm từ 0,070U/mgprotein xuống còn 0,055 U/mgprotein).
5.2 Đề nghị
Do thời gian nghiên cứu có hạn và điều kiện không cho phép nên còn một số vấn đề
chưa thực hiện được. Đề nghị tiến hành khảo sát thêm một số vấn đề sau:
- Khảo sát sử dụng một số loại hóa chất khác cho quá trình gây kết tủa protein như: NaCl, acetone, isopropanol…
- Khảo sát bổ sung một số loại hóa chất giúp ổn định hoạt tính của enzyme cellulase trong quá trình bảo quản.
- Nghiên cứu ứng dụng các phương pháp tinh sạch tiếp theo như sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion…
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy và Nguyễn Xuân Sâm. (2004). Công
nghệ enzyme.NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Lê Ngọc Tú, (2002). Hóa sinh công nghiệp. NXB Khoa học Kỹ thuật. Hà Nội. Lương Đức Phẩm, (2004). Công nghệ vi sinh vật. NXB Nông nghiệp. Hà Nội.
Nguyễn Đức Lượng, (2004). Công nghệ enzyme. NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Hồ Chí Minh.
Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa. (2007). Enzyme và ứng dụng. NXB Giáo Dục. Hà Nội. Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải. (2005). Động học các quá trình xúc tác sinh học. NXB
Khoa học Kỹ thuật. Hà Nội.
Tiếng Anh
Banerjee R. (2006), Isolation and Purification of Enzyme. In: Enzyme Technology, A. Pandey, C.
Webb, C.R. Soccol, C. Larroche (Editors), Springer, pp. 515 – 532
Ishii, S., K. Kiho, S. Sugiyama & H. Sugimoto (1979), Low–methoxyl pectin prepared by
pectinesterase from Aspergillus japonicus. Journal of Food Science, 44, 611–614.
Jamil, A et al., (2005). Purification of Endoglucanase From Trichoderma harzianum. Pakistan
Journal of Life and Social Sciences.
Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for the production of reducing sugars
analyt. pp 426-620.
Mukherjee G. and R. Banerjee (2006), Effects of temperature, pH and additives on the activity of
tannase produced by a co-culture of Rhizopus oryzae and Aspergillus foetidus. World Journal
Microbiology Biotechnology. 22, pp 207-212.
Tenkanen et al. (2003). Crystallization and preliminary X-ray analysis of a novel Trichoderma
reesei xylanase IV belonging to glycoside hydrolase family 5
Yasushi, M et al., (1998, mar). Purification and characterization of Exo-β-D-Glucosaminidase from a Cellulolytic Fungus, Trichoderma reesei PC-3-7. Applied and Environmental
Microbiology. pp 890-895.
Wedsite:
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang vii
PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các phương pháp phân tích
1. Phương pháp phân tích hoạt tính enzyme cellulase (phương pháp DNS)
(whitaker et al., 2003)
1.1 Nguyên tắc
Cơ chất CMC bị enzyme cellulase phân cắt thành đường khử. Hàm lượng đường khử tạo thành được xác định bằng cách dùng thuốc thử 3,5-dinitro salicylic acid (DNS) và máy đo quang phổở bước sóng 575 nm.
DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành 3-amino-5-nitrosalicylic acid có màu đỏ cam. Dựa vào lượng đường khử sinh ra tính hoạt tính của enzyme.
1.2 Chuẩn bị mẫu
Dung dịch CMC 1%
Cân chính xác 2 g CMC khô, hòa tan vào 180 ml nước đun nóng ở 80oC, khuấy trộn và cho thêm nước cất đến vạch 200 ml cho đến khi hòa tan hoàn toàn (khoảng 1 giờ). Sau đó lọc dung dịch vào trong bình tam giác và làm nguội đến nhiệt độ
phòng.
Chuẩn bị dung dịch thuốc thử DNS
Hòa tan 1 g acid 3,5-dinitro salicylic vào 20 ml NaOH 2N (a). Hòa tan 30 g muối kali natri tartrate vào 50 ml nước (b).
Trộn 2 dung dịch (a) và (b) lại rồi thêm nước cất vào cho đến 100 ml. Dung dịch phải để trong chai tránh sáng , đậy nắp kĩđể tránh CO2.
1.3 Tiến hành
Hoạt tính của enzyme cellulase được xác định với 1% (w/v) carboxy methyl cellulose (CMC) làm cơ chất (theo phương pháp Miller, 1959). 1ml dung dịch enzyme cellulase được ủ trong 30 phút với 1 ml CMC 1% và 1ml dung dịch đệm natri acetate 50 mM (pH 5) ở 60oC.
Sau khi phản ứng kết thúc, ta cho 3 ml thuốc thử DNS đun sôi trong vòng 10 phút rồi làm nguội ở nhiệt độ phòng và đem đi đo bước sóng qua máy quang phổở bước sóng 575 nm. Đơn vị hoạt tính của enzyme (IU/ml) được tính dựa vào đường chuẩn glucose.
Dựa vào đường chuẩn glucose xác định hàm lượng đường khử sinh ra và tính hoạt tính của enzyme.
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang viii
1.4 Xây dựng đường chuẩn glucose
Cân chính xác 1 g glucose (dạng khô không ngậm nước) hòa tan với 200ml nước cất. Sử dụng bình định mức.
Hút lần lượt 0, 2, 4, 6, 8, 10 ml dung dịch này vào 6 bình định mức 50 ml, thêm nước cho đến vạch định mức.
Các dung dịch mới pha này có nồng độ glucose lần lượt là: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mg/ml.
Thực hiện các phản ứng như trên.
Vẽđồ thị biểu thị sự biến thiên giữa nồng độ đường và độ hấp thu OD ở bước sóng 575 nm.
Dựa vào đường chuẩn glucose xác định hàm lượng đường khử sinh ra và hoạt tính enzyme.
1.5 Tính toán kết quả
Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1 ml enzyme được tính theo công thức:
180 1000 * * * = E hh V T V X U Trong đó: U: hoạt tính enzyme (U/ml)
X: hàm lượng glucose trong dung dịch đo (mg/ml)
Vhh: thể tích hỗn hợp ( enzyme, CMC, đệm natri acetate, 3 ml) T: thời gian phản ứng (30 phút)
VE: thể tích enzyme (1 ml)
1000: đổi từ mM ra µM đường khử. 180: khối lượng phân tử glucose.
Đường chuẩn đường khử
Nồng độ
glucose 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang ix
ĐƯỜNG CHUẨN ĐƯỜNG KHỬ
y = 1.1534x R2 = 0.9997 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Nồng độ glucose mg/ml O D
2. Định lượng protein bằng phương pháp Biuret
2.1 Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa nhóm –CO-NH-, -CS-NH-, C(NH)NH2 sẽ có phản ứng với Cu2+ tạo hợp chất phức màu tím.
Trong phương pháp này, protein được cho phản ứng với Cu2+ trong môi trường kiềm để tạo phức màu tím; cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Do đó ta có thểđịnh lượng protein theo phương pháp so màu ở bước sóng 550nm.
2.2 Chuẩn bị mẫu
Dung dịch protein chuẩn
Dung dịch albumin huyết thanh bò (BSA – bovine serum albumin) 20 mg/ml pha trong dung dịch NaCl 0,9%.
Dung dịch thuốc thử Biuret
Hòa tan 1,5g CuSO4.5H2O và 6g K, Na tartrate với nước cất trong mỗi cốc thủy tinh 50 mL. Riêng cốc có K, Na tartrate thì ta ngâm trong nước nóng, kết hợp với khuấy trộn để cho K, Na tartrate tan được nhanh hơn so với nước ở nhiệt độ phòng.
Hòa tan 30g NaOH với nước cất trong cốc 200 ml cho đến khi NaOH tan hết. Tiếp theo ta để nguội đến nhiệt độ phòng.
Sau đó, cho tất cả vào bình định mức 1000 ml, rồi thêm nước cho đến vạch định mức.
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang x
2.3 Tiến hành
Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn
Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0 – 20 mg/ml từ dung dịch protein gốc (BSA 20 mg/ml)
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nồng độ dung dịch (mg/ml) 0 4 8 12 16 20 Thể tích dung dịch protein chuẩn (µl) 0 100 200 300 400 500 Thể tích dung dịch NaCl 0,9% (µl) 500 400 300 200 100 0
Thể tích nước cất (ml) 1 1 1 1 1 1
Thuốc thử Biuret (ml) 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5
Chuẩn bị dung dịch phân tích Cho vào ống nghiệm:
500 µl dung dịch phân tích (dung dịch enzyme) 1 ml nước cất
3,5 ml thuốc thử Biret
Sau khi chuẩn bị các dung dịch trên, lắc đều, để yên 20 phút. Quan sát dãy dung dịch và đo độ hấp thụở bước sóng 550 nm.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ A vào nồng độ dung dịch protein chuẩn.
Từ giá trị độ hấp thụ của dung dịch phân tích, có thể suy ra nồng độ protein trong dung dịch mẫu dựa vào đường chuẩn.
2.4 Tính toán kết quả
Từ kết quảđọc được trên máy, ta xác định được nồng độ protein dung dịch enzyme trong dung dịch phân tích dựa vào đường chuẩn: X mg/ml.
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xi
Đường chuẩn protein
Hàm lượng protein 0 4 8 12 16 20
OD 0 0,09 0,193 0,281 0,363 0,445
ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN
y = 0.0227x R2 = 0.998 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0 5 10 15 20 25 Hàm lượng protein mg/ml O D
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xii
Phụ lục 2. Phương pháp pha dung dịch đệm Natri acetate
Enzyme sau khi kết tủa sẽđược hòa tan bằng dung dịch đệm Natri acetate 50 mM (pH 5).
Cách pha:
Cân 6,8 g natri acetate khan cho vào bình định mức 1000 ml, tiếp theo cho nước đến
đủ 1000 ml, khuấy đều cho tan hết. Sau đó lấy ra 352 ml.
Hút 2,857 ml dung dịch acid acetic đậm đặc vào bình định mức 1000 ml, tiếp theo dẫn nước vào cho đủ 1000 ml, khuấy đều cho tan hết. Sau đó lấy ra 148 ml.
Cho 352 ml dung dịch natri acetate và 148 ml dung dịch acid acetic vào bình định mức 1000 ml, tiếp theo cho nước đến vạch 1000 ml. Ta được dung dịch đệm natri acetate 50 mM (pH 5).
Phụ lục 3. Các công thức tính toán Chỉ tiêu Phương pháp
Hoạt tính của cellulase (U/mL)
Phương phápMiller, sử dụng DNS làm thuốc thử và đo độ hấp thụở bước sóng 575nm.
Hàm lượng protein tổng (mg/mL)
Phương pháp Biuret, sử dụng bovine serum albumin (BSA) làm đường chuẩn và đo ở bước sóng 550 nm. Hiệu suất thu hồi cellulase Y% 100 (%)