khả năng kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp
(i) Mục đích:
Tìm ra loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng phù hợp nhằm đạt hiệu quả kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp tốt nhất mà không làm biến tính cellulase từ
Trichoderma sp. (ii) Tiến hành:
Thí nghiệm được tiến hành theo phương thức kết hợp 2 nhân tố với 3 lần lặp lại. Nhân tố A: Hóa chất dùng để kết tủa enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp, có 2
loại hóa chất
A1: Ammonium sulfate A2: ethanol Nhân tố B: Tỉ lệ hóa chất sử dụng: dịch chiết enzyme thô
Nhân tố B1: Tỷ lệ ammonium sulfate : enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp
(w/v), thay đổi ở 10 mức độ
B1.1: 30% B1.2: 35% B1.3: 40% B1.4: 45% B1.5: 50% B1.6: 55% B1.7: 60% B1.8: 65% B1.9: 70% B1.10: 75%
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 18
Nhân tố B2: Tỷ lệ ethanol : enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp (v/v), thay đổi
ở 7 mức độ
B2.1: 1,5 : 1 B2.2: 2 : 1 B2.3: 2,5 : 1 B2.4: 3 : 1 B2.5: 3,5 : 1 B2.6: 4 : 1 B2.7: 4,5 : 1
Số nghiệm thức thí nghiệm: 17 nghiệm thức Số mẫu thí nghiệm: 17 x 3 = 51 mẫu
Dung dịch enzyme thô được làm lạnh đến 4oC trước khi tiến hành thí nghiệm này.
Đong 10 ml dịch chiết enzyme cellulose thô vào 10 ống nghiệm sạch, sau đó cho (NH4)2SO4 tinh thểđể có dung dịch đạt 10 mức nồng độ: 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75% bão hòa vào từng ống nghiệm, lắc đều cho đến khi tan hết và giữở 40C trong 2 giờ. Đối với kết tủa bằng dung môi hữu cơ, dung môi hữu cơ được làm lạnh trước đến nhiệt độ –4oC, cho từ từ vào các ống nghiệm chứa enzyme thô theo các tỷ
lệ nhưđã bố trí, lắc nhẹ và để ổn định 2 giờ ở 4oC.
Sau khi kết tủa, hỗn hợp được ly tâm trong máy ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút cũng ở 4oC. Sau ly tâm thu được kết tủa.
Cân khối lượng kết tủa thu được.
Kết tủa sau khi ly tâm được hòa tan trong 10 ml dung dịch đệm natri acetate 50 mM (pH 5).
Hoạt tính của enzyme cellulase được xác định với 1% (w/v) carboxy methyl cellulose (CMC) làm cơ chất (theo phương pháp Miller, 1959). 1ml dung dịch enzyme cellulase được ủ trong 30 phút với 1 ml CMC 1% và 1ml dung dịch đệm natri acetate 50 mM (pH 5) ở 60oC.
Sau khi phản ứng kết thúc, ta cho 3 ml thuốc thử DNS đun sôi trong vòng 10 phút rồi làm nguội ở nhiệt độ phòng và đo độ hấp thu qua máy quang phổ ở bước sóng 575 nm. Đơn vị hoạt tính của enzyme (IU/ml) được tính dựa vào đường chuẩn glucose.
3.3.2 Thí nghiệm 2. Khảo sát sự biến đổi hoạt tính và hàm lượng protein theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ lạnh đông
Enzyme sau khi ly tâm sẽ được bảo quản ở -20oC và đo hoạt tính, hàm lượng protein sau mỗi 7 ngày trong vòng 28 ngày.