2.2.1 Nguyên lý của quy trình định lượng bilirubin toàn phần trên máy hóa sinh tự động
Phương pháp đo quang bilirubin toàn phần trong huyết thanh phản ứng với muối diazo (3,5-dichlorophenyl diazonium tetrafluoroborat) trong môi trường có chất gia tốc (cafein) tạo phức hợp azobilirubin. Phức hợp màu hồng
tím tỉ lệ thuận với nồng độ bilirubin toàn phần trong huyết thanh, được xác định ở bước sóng 540 nm. Một mẫu trắng riêng biệt được thực hiện để hạn chế sự ảnh hưởng của các chất gây nhiễu nội sinh trong huyết thanh [2, 3].
2.2.2 Nguyên lý của kỹ thuật định lượng bilirubin toàn phần trên máy GEM 4000 (Phương pháp quang phổ trực tiếp)
Bilirubin hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 454 nm, không hấp thụ ánh sáng tại 540 nm. OxyHb hấp thụ ánh sáng như nhau ở hai bước sóng 454 nm và 540 nm. Vì vậy, độ hấp thụ ánh sáng của bilirubin trong mẫu thử tại 454 nm sẽ bằng độ hấp thụ tại bước sóng 454 nm trừ đi độ hấp thụ tại bước sóng 540 nm [21].
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tất cả các thực nghiệm đánh giá độ tuyến tính và độ chính xác đều được tiến hành song song trên máy hóa sinh tự động Beckmann Coulter và GEM 4000.
2.3.1. Thực nghiệm đánh giá độ tuyến tính
Chuẩn bị hai hỗn hợp mẫu huyết tương từ trẻ sơ sinh. Một mẫu gần với giới hạn phát hiện dự kiến và một gần với giới hạn trên dự kiến. Thể tích của mỗi mẫu là khoảng 60 ml. 6 hỗn hợp sẽ được chuẩn bị bằng cách trộn mẫu có nồng độ thấp và mẫu có nồng độ cao với tỷ lệ khác nhau.
Thực hiện đo 3 lần cho mỗi mẫu. Giá trị trung bình của các lần đo và các giá trị mong đợi sẽ được vẽ trên đồ thị tuyến tính và kiểm tra mối quan hệ tuyến tính.
Bảng 2.1. Cách pha các mẫu dùng cho thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính
Dự kiến nồng độ thu được
(µmol/L)
Tỷ lệ pha trộn hai mẫu (%) Mẫu có nồng độ bilirubin thấp (%) Mẫu có nồng độ bilirubin cao (%) Hỗn hợp 1 100 0 Hỗn hợp 2 80 20 Hỗn hợp 3 60 40 Hỗn hợp 4 40 60 Hỗn hợp 5 20 80 Hỗn hợp 6 0 100 2.3.2.Xác định độ chính xác
Huyết tương từ trẻ sơ sinh có nồng độ bilirubin máu bình thường sẽ được thu thập và trộn lại tạo hỗn hợp, chia nhỏ thành 30 ống nhỏ (0,5 ml mỗi ống).
Huyết tương từ trẻ sơ sinh tăng bilirubin máu sẽ được thu thập. Sau đó trộn lẫn tạo hỗn hợp, chia vào 30 ống nhỏ mỗi ống 0,5 ml huyết tương.
Hai loại huyết tương này sẽ được bảo quản ở -20oC cho đến khi phân tích.
Độ chính xác ngắn hạn
Hai loại huyết tương được tiến hành xét nghiệm trong một ngày (n = 10) trên Gem 4000 và Becman Coulter AU 2700. Hai mức huyết thanh kiểm tra của Bio-Rad luôn được phân tích cùng để đảm bảo các kết quả thu được là chấp nhận được. Tính giá trị trung bình, SD và CV của kết quả thu được
với hai loại mẫu huyết tương trên hai máy để đánh giá độ chính xác ngắn hạn. Tiêu chuẩn chấp nhận của độ chính xác ngắn hạn là nhỏ hơn 25% sai số toàn bộ cho phép. Bảng 2.2. Độ chính xác ngắn hạn GEM 4000 AU 2700 Mức thấp Mức cao Mức thấp Mức cao n 10 10 10 10 Trung bình SD CV% Độ chính xác dài hạn
Tiến hành phân tích hai loại mẫu bilirubin hàng ngày để đánh giá độ chính xác dài hạn (n = 22). Thời gian đánh giá độ chính xác dài hạn được tiến hành trong 1 tháng. Huyết thanh kiểm tra chất lượng được phân tích mỗi ngày để đảm bảo rằng các kết quả thu được là chấp nhận được. Tính toán giá trị trung bình, SD và CV để đánh giá độ chính xác dài hạn. Tiêu chuẩn chấp nhận của độ chính xác dài hạn là nhỏ hơn 33% sai số toàn bộ cho phép.
Bảng 2.3. Độ chính xác dài hạn
GEM 4000 AU 2700
Mức thấp Mức cao Mức thấp Mức cao
Trung bình SD CV%
2.3.3. Nghiên cứu so sánh
40 mẫu máu toàn phần tĩnh mạch của trẻ sơ sinh sẽ được thu thập vào ống chống đông bằng heparin. Nồng độ bilirubin của các mẫu nằm trong dải tuyến tính của phương pháp xét nghiệm cần đánh giá. Các mẫu sẽ được phân tích trên GEM 4000 sau đó phần còn lại của mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm (bảo vệ khỏi ánh sáng) để phân tích trên máy hóa sinh tự động. Tách huyết tương của các mẫu và phân tích trên máy Beckman Coulter AU 2700. Nghiên cứu so sánh kéo dài trong khoảng thời gian một tháng, mỗi ngày 5 - 6 mẫu bệnh phẩm sẽ được phân tích trong vòng hai giờ trên máy GEM 4000 và Beckman Coulter AU 2700.
Phân tích dữ liệu: Dữ liệu thu thập từ hai phương pháp này sẽ được đánh giá về mặt thống kê bằng phần mềm Methval của Philip Marquez xem kết quả xét nghiệm thu được từ hai phương pháp phân tích có tương đồng nhau không.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ
Hình 3.1. Đồ thị đánh giá độ tuyến tính của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy GEM 4000
Nhận xét: Phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy GEM 4000 có giới hạn tuyến tính là 8.5 đến 350.4 µmol/L. Phương trình tuyến tính là y= 1.004x – 0.5503.
Hình 3.2. Đồ thị đánh giá độ tuyến tính của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy AU 2700
Nhận xét: Phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy AU 2700 có giới hạn tuyến tính là 5.4 đến 380.6 µmol/L. Phương trình tuyến tính là y= 0.9998x + 0.01518.
Bảng 3.1: Độ lệch và phần trăm sai số trong đánh giá độ tuyến tính trên máy Gem 4000 Mẫu Nồng độ trung bình đo được (Y ) (µmol/L) Giá trị lý thuyết (X) (µmol/L) Độ lệch (Y- X) % Sai số Mẫu 1 8.47 8.5 -0.03 Không áp dụng Mẫu 2 75.03 76.88 -1.85 -2.41 % Mẫu 3 146.53 145.26 1.27 0.87 % Mẫu 4 213.8 213.64 0.16 0.07 % Mẫu 5 283.8 282.02 1.78 0.63 % Mẫu 6 350.53 350.4 0.13 0.04 %
Nhận xét: Tất cả độ lệch và phần trăm sai số ở mỗi một mức độ đều nhỏ hơn sai số cho phép.
Bảng 3.2. Độ lệch và phần trăm sai số trong đánh giá độ tuyến tính trên máy AU 2700
Mẫu
Nồng độ trung bình đo được (Y)
(µmol/L) Giá trị lý thuyết (X) (µmol/L) Độ lệch (Y- X) % Sai số Mẫu 1 5.43 5.4 0.03 Không áp dụng
Mẫu 2 81.03 80.44 0.59 0.73 % Mẫu 3 155.3 155.48 -0.18 -0.12% Mẫu 4 229.3 230.52 -1.22 -0.53 %
Mẫu 5 305.8 305.56 0.24 0.08 %
Mâu 6 380.97 380.6 0.37 0.97%
Nhận xét: Tất cả độ lệch và phần trăm sai số ở mỗi một mức độ đều nhỏ hơn sai số cho phép.
3.2 THỰC NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ CHÍNH XÁC
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ chính xác ngắn hạn của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy GEM 4000 và AU2700
GEM 4000 AU 2700
Mức thấp Mức cao Mức thấp Mức cao
n 10 10 10 10
Nồng độ trung bình
SD 1.81 7.11 0.30 1.99
CV% 6.50 5.00 1.38 1.63
Nhận xét:
Sai số toàn bộ cho phép của xét nghiệm định lượng bilirubin toàn phần là 31.1% [23].
Độ biến thiên CV của máy GEM 4000 ở hai mức đều lớn hơn 5%, nhưng hơn nhỏ hơn 25% của sai số toàn bộ cho phép (0.25x 31.3%= 7.78%).
Độ biến thiên CV của máy AU 2700 ở hai mức đều nhỏ hơn 5%.
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ chính xác dài hạn của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy GEM 4000 và AU2700
GEM 4000 AU 2700 Mức thấp Mức cao Mức thấp Mức cao N 22 22 22 22 Nồng độ bilirubin trung bình (µmol/L) 27.83 131.13 22.18 132.27 SD 1.60 2.26 1.95 9.33 CV% 5.75 1.73 8.78 7.06 Nhận xét:
Sai số toàn bộ cho phép của xét nghiệm định lượng bilirubin toàn phần là 31.1%. [23]
Độ biến thiến CV của máy GEM 4000 ở mức thấp lớn hơn 5%, còn ở mức cao nhỏ hơn 5%. Độ biến thiên CV của máy AU 2700 ở cả hai mức đều lớn hơn 5%, nhưng đều nhỏ hơn 33% sai số toàn bộ cho phép (0.33 x 31.1% = 10.26%).
3.3 THỰC NGHIỆM SO SÁNH
Intercept : -3.276 [ -7.546 to -0.216 ]Slope : 0.932 [ 0.872 to 0.997 ] Passing-Bablok agreement test N = 41
0 100 200 300 400 AU2700 umol/L 0 100 200 300 400 GEM4000 umol/L
Hình 3.3. Đồ thị so sánh kết quả định lượng bilirubin toàn phần trên máy Gem 4000 và máy AU 2700
Nhận xét: Trong vòng 1 tháng, 41 mẫu máu toàn phần đã được tiến hành phân tích song song trên máy GEM 4000 và máy AU 2700 theo quy trình được xây dựng tại phòng xét nghiệm. Đồ thị có độ dốc là 0.932 và giao điểm là 0.
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN
Định lượng nồng độ bilirubin toàn phần trong máu đóng vai trò vô cùng quan trọng trong chẩn đoán và điều trị vàng da sơ sinh hay còn gọi là tăng bilirubin máu sơ sinh. Phần lớn trẻ sơ sinh bị vàng da với mức độ nhẹ, nhưng sự tăng bilirubin cấp tính và dai dẳng ở trẻ sơ sinh có thể ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương gây vàng da nhân (kerniterus). Phần lớn các trường hợp tăng bilirubin ở trẻ sơ sinh được điều trị bằng liệu pháp ánh sáng, các ca bệnh tăng bilirubin nặng được điều trị bằng thay máu (exchange transfusion). Hiệp hội các nhà nhi khoa Mỹ đưa ra hướng dẫn đánh giá nguy cơ của tăng bilirubin máu và các lựa chọn điều trị cần thiết dựa trên việc định lượng nồng độ bilirubin toàn phần trong máu. Ở người lớn, nồng độ bilirubin toàn phần được dùng theo dõi đánh giá chức năng gan và các vấn đề liên quan đến vàng da.
Thông thường bilirubin toàn phần trong máu được định lượng trên các máy phân tích hóa sinh sử dụng huyết tương/huyết thanh. Gần đây, việc định lượng bilirubin trong máu toàn phần được tiến hành trên máy đo khí máu giúp loại bỏ bước phân tách huyết tương/huyết thanh. Phương pháp này có độ chính xác tương tự như phương pháp tiến hành trên các máy phân tích hóa sinh. GEM 4000 là máy phân tích khí máu có thể đo lường các thông số khí máu, các chất điện giải, một số chất chuyển hóa (glucose, lactat) bằng hệ thống cartridge. Việc định lượng bilirubin toàn phần đã được tích hợp vào hệ thống GEM 4000. Việc sử dụng thiết bị chăm sóc tại chỗ này có thể sẽ rất thích hợp cho những cơ sở điều trị sơ sinh vì lợi ích của việc chỉ cần sử dụng một lượng máu nhỏ tránh gây thiếu máu do điều trị, kết quả xét nghiệm có sau
vài phút kể từ khi lấy máu giúp việc đưa ra quyết định chẩn đoán và điều trị nhanh chóng, kịp thời. Tuy nhiên, việc đánh giá xem liệu phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên GEM 4000 có kết quả tương tự như phương pháp tham chiếu tại phòng xét nghiệm hay không là việc làm cần thiết trước khi quyết định sử dụng phương pháp này cho mục đích chẩn đoán và theo dõi điều trị vàng da sơ sinh.
Nghiên cứu này được tiến hành nhằm đánh giá phương pháp định lượng bilirubin trên GEM 4000, do vậy việc xác định giới hạn tuyến tính là một yêu cầu bắt buộc. Để so sánh, chúng tôi tiến hành thực nghiệm song song trên cả máy phân tích hóa sinh tự động Beckman Coulter AU 2700. Đồ thị 3.1 cho thấy, khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy GEM 4000 là 8.5 đến 350.4 µmol/L. Phương trình tuyến tính là y= 1.004x – 0.5503. Giới hạn tuyến tính thu được trong thực nghiệm này thấp hơn so với tuyên bố của nhà sản xuất (11- 617 µmol/L) [20], điều này do trong điều kiện thực nghiệm chúng tôi chưa thu thập đủ các mẫu bệnh phẩm có nồng độ bilirubin cao. Do vậy, từ kết quả thu được chỉ có thể khẳng định là phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên GEM 4000 ít nhất tuyến tính đến 350 µmol/L. Đồ thị 3.2 cho thấy máy phân tích hóa sinh AU 2700 là có giới hạn tuyến tính cho phép định lượng bilirubin là 5.4 đến 380.6 µmol/L. Phương trình tuyến tính là y= 0.9998x + 0.01518. Giới hạn tuyến tính này cũng hẹp hơn so với tuyên bố của nhà sản xuất (0-513 µmol/L). Độ dốc của cả hai đồ thị đều xấp xỉ 1 và giao điểm xấp xỉ 0. Bảng 3.1 và bảng 3.2 cho thấy độ lệch và phần trăm sai số của tất cả các hỗn hợp thử nghiệm đều nhỏ hơn sai số cho phép. Mặc dù khoảng tuyến tính này nhỏ hơn tuyên bố của nhà sản xuất nhưng bao phủ cả vùng giới hạn có ý nghĩa chẩn đoán bệnh và đưa ra quyết định điều trị. Tuy nhiên, việc tiếp tục thu thập các mẫu bệnh phẩm có nồng độ bilirubin cao hơn nữa và tiến hành lại thử nghiệm đánh giá khoảng
tuyến tính của GEM 4000 là cần thiết.
Sau khi đã xác định được khoảng tuyến tính, việc tiếp theo là xác định độ chính xác của phương pháp tại các nồng độ mà kết quả xét nghiệm của bệnh nhân có ý nghĩa quyết định về mặt lâm sàng. Thực nghiệm xác định độ chính xác cho phép đánh giá sai số ngẫu nhiên của phép phân tích. Thực nghiệm xác định độ chính xác của phương pháp định lượng bilirubin trên máy GEM 4000 được tiến hành trên hai mức nồng độ bilirubin thấp và cao. Để so sánh, chúng tôi tiến hành cả trên máy AU 2700. Kết quả bảng 3.3 cho thấy độ biến thiên (CV) của thực nghiệm đánh giá độ chính xác ngắn hạn và độ chính xác dài hạn của hai mức đều đạt tiêu chuẩn. Trong độ chính xác ngắn hạn: Hai loại huyết tương được tiến hành xét nghiệm trong một ngày (n = 10) trên GEM 4000 và AU 2700. Hai mức huyết thanh kiểm tra của Bio-Rad luôn được phân tích cùng để đảm bảo các kết quả thu được là chấp nhận được. Tính giá trị trung bình, SD và CV của kết quả thu được với hai loại mẫu huyết tương trên hai máy để đánh giá độ chính xác ngắn hạn. Tiêu chuẩn chấp nhận của độ chính xác ngắn hạn là nhỏ hơn 25% sai số toàn bộ cho phép. Kết quả bảng 3.1 cho thấy độ biến thiên (CV) trong một mẻ chạy và giữa các lần chạy của hai mức đều đạt tiêu chuẩn. Căn cứ vào tiêu chuẩn mong muốn cho xét nghiệm định lượng bilirubin thì CV <11.1 %, sai số toàn bộ cho phép là <31.3% [23]. CV của máy GEM 4000 trong đánh giá độ chính xác ngắn hạn với hai mức nồng độ bilirubin thấp và cao lần lượt là 6.5% và 5.0% , đều nhỏ hơn 0.25 lần sai số toàn bộ cho phép (0.25 x 31.3% = 7.825%). CV của máy AU 2700 trong đánh giá độ chính xác ngắn hạn với hai mức nồng độ bilirubin thấp và cao lần lượt là 1.38% và 1.63 %, đều nhỏ hơn 5%. Tương tự, CV của máy GEM 4000 trong độ chính xác dài hạn với hai mức nồng độ bilirubin thấp và cao lần lượt là 5.75% và 1.73%, đều nhỏ hơn 0.33 lần sai số toàn bộ cho phép (0.33 x 31.3= 10.4%). CV của máy AU 2700 trong độ chính xác dài
hạn với hai mức nồng độ bilirubin lần lượt là 8.78% và 7.06 %, đều nhỏ hơn 0.33 lần sai số toàn bộ cho phép (0.33 x 31.3%= 10.4%). Điều thú vị ở đây là phương pháp định lượng bilirubin trên GEM 4000 có độ chính xác dài hạn ở mức tối ưu, còn máy AU 2700 chỉ đạt mức mong muốn khi so với tiêu chuẩn được trình bày bởi Ricos [23]. Như vậy, độ chính xác của xét nghiệm định lượng bilirubin bằng máy GEM 4000 và AU 2700 ở các giá trị có ý nghĩa lâm sàng là chấp nhận được.
Thực nghiệm so sánh được tiến hành để đánh giá độ không xác thực (inaccuracy) hay sai số hệ thống. Thông thường, ta tiến hành thực nghiệm này bằng cách phân tích mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp mới và bằng phương pháp so sánh, rồi đánh giá sai số dựa trên sự khác biệt giữa kết quả thu được từ hai phương pháp. Trong nghiên cứu này, 41 mẫu máu toàn phần tĩnh mạch của trẻ sơ sinh được thu thập vào ống chống đông bằng heparin. Nồng độ bilirubin của các mẫu nằm trong dải tuyến tính của phương pháp xét nghiệm cần đánh giá. Các mẫu được phân tích trên GEM 4000 sau đó phần còn lại của mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm (bảo vệ khỏi ánh sáng) để phân tích trên máy hóa sinh tự động. Tách huyết tương của các mẫu và phân tích trên máy Beckman Coulter AU 2700. Nghiên cứu so sánh kéo dài trong khoảng thời gian một tháng, mỗi ngày 5 - 6 mẫu bệnh phẩm được phân tích trong