Reverse hybridization và tỷ lệ các loại đột biến
4.2.1. Tỷ lệ phát hiện đột biến
Tỷ lệ phát hiện đột biến gen trong nghiên cứu của chúng tôi được thể hiện qua bảng 3.6: trong 92 mẫu dịch ối được xét nghiệm có 64 trường hợp (69,6%) mang đột biến gen. Tỷ lệ phát hiện đột biến gen của chúng tôi khá cao (69,6%), điều này được giải thích là do đối tượng nghiên cứu của chúng tôi đều thực hiện trên các trường hợp thai có nguy cơ cao (của các cặp vợ chồng mang đột biến gen α- hoặc β-thalassemia hoặc nghi ngờ mang gen đột biến này thông qua các xét nghiệm sàng lọc: chỉ số MCV, MCH và kết quả điện di hemoglobin), tương tự như nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan (2011). Tác giả thực hiện nghiên cứu nhằm phân tích đặc điểm phân bố đột biến gen Thalassemia trên các trường hợp chẩn đoán trước sinh tại bệnh viện Từ Dũ từ 1/12/2007 đến 31/3/2010. Tất cả các trường hợp thai của các cặp vợ chồng mang đột biến gen α- hoặc β-thalassemia được tiến hành chọc ối tìm đột biến gen bằng kỹ thuật ARMS-PCR, gap-PCR, enzyme giới hạn và MLPA. Kết quả: trong 290 thai được chẩn đoán trước sinh, phát hiện 207 thai có đột biến (207/290; 71,4%), 83 thai (29,6%) không phát hiện thấy đột biến bằng các phương pháp trên.
Trong nghiên cứu của chúng tôi có 64 thai (69,6%) phát hiện có mang 1 hoặc nhiều đột biến, 28 thai (30,4%) không phát hiện thấy đột biến trong số 21 đột biến trên gen α globin và 22 đột biến trên gen β globin được sàng lọc. Trong số 64 trường hợp được phát hiện có mang đột biến gen, có 45 mẫu là đột biến α-thalassemia, gấp 2,4 lần so với đột biến β-thalassemia (19 trường hợp). Kết quả này của chúng tôi là tương đương so với nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan (2011), tỷ lệ đột biến và không đột biến tương ứng là 71,4% và 28,6% [61], và trong số 207 thai phát hiện có đột biến, có 108 thai
là đột biến α-thalassemia (128/290; 44%) gấp hơn 2 lần số thai mang đột biến β-thalassemia (59/290; 20,3%). Sự khác biệt này là do số thai được chẩn đoán trước sinh cho bệnh α-thalassemia (64 thai) cao hơn hẳn so với các thai được chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia (28 thai). Nguyên nhân có thể là vì những thai mang đột biến gen β-thalassemia ngay cả khi có kiểu gen đồng hợp cũng không có biểu hiện bất thường trên siêu âm nên thai phụ không chú ý để chẩn đoán trước sinh, trừ những trường hợp họ đã có con trước bị bệnh này phải truyền máu thì họ mới chú ý cho việc mang thai lần này và chủ động để tham gia chẩn đoán trước sinh cho bệnh này, trong khi những thai α- thalassemia thể đồng hợp thường có dấu hiệu phù thai, hoặc những thai phụ này đã có tiền sử phù thai ở những lần thai trước được các bác sĩ khuyên hoặc họ cũng tìm hiểu để có thể nghĩ nhiều đến bệnh tan máu này mà tham gia làm chẩn đoán trước sinh nhiều hơn so với trường hơp β-thalassemia.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ đột biến gen α globin được phát hiện cao hơn hẳn so với đột biến gen β globin cũng tương tự với nhiều nghiên cứu trên thế giới, đã xác định tỷ lệ người mang gen bệnh α-thalassemia chung trên toàn thế giới khá cao (miền bắc Thái Lan và Lào là 30 ÷ 40%, Nam Trung Quốc là 8,53%, Malaysia là 4,5% và Philipin là 5%) [71], [72], [73]. Người mang gen α-thalassemia có cuộc sống khỏe mạnh bình thường, không cần bất cứ điều trị gì. Tuy nhiên, do bệnh có khả năng di truyền nên họ có nguy cơ đẻ con α-thalassemia nếu kết hôn với người mang gen α-thalassemia khác. Người con của họ là bình thường hay α-thalassemia mức độ nhẹ/ trung bình/ nặng phụ thuộc vào kiểu gen của người bố và người mẹ. Vì vậy việc xác định tình trạng mang gen và kiểu gen α-thalassemia là vô cùng cần thiết, có ý nghĩa phòng ngừa bệnh α-thalassemia cho cộng đồng.
Nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Schu-Rern Chern (Đài Loan) khi thực hiện chẩn đoán trước sinh cho 57
trường hợp thai có nguy cơ cao với tỷ lệ phát hiện đột biến và không có đột biến lần lượt là 70,1% và 29,9% [74].
4.2.2. Tỷ lệ các loại đột biến
Trong số 92 mẫu ối được khảo sát tìm đột biến, có 64 trường hợp tìm đột biến α-thalassemia (69,6%) và 28 trường hợp được sàng lọc tìm đột biến β-thalassemia (30,4%).
Với α-thalassemia, tỷ lệ phát hiện đột biến là 45 trong tổng số 64 trường hợp (70,3%), trong đó đột biến dạng --SEA là phổ biến nhất (88,9%), sau đó là đột biến -α3.7 (6,7%) và -(α)20.5 (4,4%). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan (2008) và Ngô Diễm Ngọc (2010) [61], [63], và cũng phù hợp với y văn về các đột biến phổ biến trong quần thể người Đông Nam Á [10], [74], [75], [76]. Đặc biệt chúng tôi phát hiện được 2 trường hợp mang đột biến -(α)20.5, là đột biến mất đoạn toàn bộ gen HBA2 và đầu 5’ của gen HBA1. Đây là một đột biến lớn nhưng khá hiếm gặp ở người Việt Nam, qua đó cho thấy ưu điểm của Reverse hybridization trong việc sàng lọc cùng lúc nhiều đột biến trên gen α globin. Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi không phát hiện thấy trường hợp nào mang đột biến –α4.2 hay HbCs, là những đột biến hay gặp ở người Việt Nam, có thể là do lượng mẫu nghiên cứu của chúng tôi chưa đủ lớn, và thực hiện trên một nhóm đối tượng nhất định nên chưa thể khái quát về các loại đột biến thường gặp ở người Việt Nam.
Các đột biến β-thalassemia được phát hiện bao gồm : CD17, CD41/42, CD26, CD71/72, CD95 và IVS 1.1. Các đột biến chiếm đa số là CD17 và CD41/42 (đều là 29,4%) cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây [11], [24], [61], [75], [77], [78], [79]. Ngoài ra, chúng tôi cũng phát hiện thấy 4 trường hợp mang kiểu gen dị hợp tử kép 2 đột biến khác nhau. Các trường
hợp dị hợp tử kép 2 đột biến đều biểu hiện bệnh Thalassemia thể nặng sau sinh, nên việc phát hiện các đột biến dạng này rất quan trọng, giúp đưa ra lời khuyên di truyền kịp thời cho gia đình bệnh nhân, nhằm tránh cho ra đời những đứa trẻ bệnh nặng. Phương pháp Reverse hybridization tỏ ra ưu việt trong việc phát hiện đồng thời cùng lúc nhiều đột biến chỉ qua 1 bước, chứ không cần sàng lọc các đột biến theo từng bước như các phương pháp thông thường [48], [61], [64], [77], như vậy giảm tối đa thời gian chờ đợi kết quả vì theo phương pháp này kết quả được biết chỉ mất trung bình khoảng 6 - 8 giờ làm việc. Đây là một ưu điểm nữa của phương pháp Reverse hybridization sử dụng StripAssay cho xét nghiệm này.
4.2.3. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia
Trong nghiên cứu của chúng tôi có 92 cặp vợ chồng được tiến hành chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia cho thai, trong đó nguy cơ bệnh phù thai do Hb Bart's là 61/92 (66,3%), bệnh HbH 3/92 (3,3%) và bệnh β- thalassemia 28/92 (30,4%).
Kết quả có 34 thai không phát hiện đột biến gây bệnh, 36 thai dị hợp tử (người lành mang gen bệnh) và 22 thai mắc bệnh thể nặng (trong đó có 16 thai mắc Hb Bart's và 6 thai mắc β-thalassemia). Không phát hiện trường hợp nào mắc HbH. Tỷ lệ thai mắc bệnh trong nghiên cứu của chúng tôi là 23,9%, kết quả này của chúng tôi cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan (2011) là 21,4% và thấp hơn nghiên cứu của Ngô Diễm Ngọc (2015) là 29,2% [80]. Những trường hợp này được dự đoán gây phù thai hoặc thiếu máu nặng sau sinh cần truyền máu thường xuyên, do đó cần kết hợp với bác sỹ lâm sàng để tư vấn di truyền cho các cặp bố mẹ của thai về kiểu gen và tiên lượng sau sinh. Tất cả các trường hợp này đều lựa chọn chấm dứt thai kỳ sau khi được tư vấn di truyền.
Trong 64 thai được chẩn đoán trước sinh bệnh α-thalassemia, thai mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến dạng --SEA/--SEA chiếm 25%, đúng với tỷ lệ lý thuyết. Thai dị hợp tử đột biến dạng --SEA chiếm tỷ lệ cao nhất (37,5%), tiếp theo là -α3.7 (4,7%) và -(α)20.5 (3,1%). Điều này cũng phù hợp với công bố của hiệp hội Thalassemia quốc tế: hiện nay trên thế giới có khoảng 60 triệu người mang gen --SEA/αα, tập chung chủ yếu ở các nước Đông Nam Á trong đó có Việt Nam [81], [82]. Các trường hợp thai mang đồng hợp tử đột biến dạng -- SEA/--SEA (gây hội chứng phù thai Hb Bart’s) không thể sản xuất chuỗi α globin để cấu thành nên HbF và HbA. Máu thai nhi chứa toàn Hb Bart’s (γ4). Các thai nhi này sống được là nhờ một lượng nhỏ huyết sắc tố phôi thai Portland1 (ζ2γ2) và Portland2 (ζ2β2) sản xuất ra. Tuy nhiên, giai đoạn này chúng thường có nhiều bất thường bẩm sinh liên quan đến tim, xương, hệ thống niệu sinh dục và thai nhi thường chết trong bụng mẹ hoặc chết ngay sau sinh. Hơn nữa, các thay đổi do phù thai cũng dẫn tới người mẹ có thể gặp các biến chứng như tiền sản giật, xuất huyết, thiếu máu hay nhiễm trùng huyết. Với mức độ nghiêm trọng của hội chứng Hb Bart’s đối với thai nhi và biến chứng có thể xảy ra cho người mẹ, các sản phụ mang thai được chẩn đoán hội chứng Hb Bart’s thường được tư vấn để chấm dứt thai kỳ càng sớm càng tốt [83], [84], [85], [86]. Mặc dù trên thực tế có rất nhiều nguyên nhân gây phù thai như: miễn dịch, nhiễm trùng, bệnh lý di truyền, nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy, ở Đông Nam Á, bệnh Hb Bart’s là nguyên nhân chính gây phù thai ở 3 tháng cuối thai kỳ, chiếm tỷ lệ 60 ÷ 90 % [81], [82]. Vì vậy với các thai phụ có thai bị phù thì ngoài các xét nghiệm thường quy như xác định yếu tố Rh-, hoặc tìm các căn nguyên nhiễm trùng như toxoplasma, cần được tiến hành sàng lọc người mang gen bệnh α-thalassemia [87]. Chúng tôi hiện cũng đang áp dụng theo quy trình này tại Trung tâm Chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện Phụ sản Trung Ương.
Đối với 28 thai nhi được chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia, tỷ lệ thai dị hợp tử đột biến CD17 và CD41/42 là cao nhất (cùng là 7,1%), sau đó là các kiểu gen: CD71/72, CD95, IVS 1-1 (đều là 3,6%). Thai mắc β- thalassemia thể nặng có kiểu gen đồng hợp tử CD17 và dị hợp tử kép CD26 / CD41/42 là chủ yếu (7,1%), tiếp đó là kiểu gen CD26 / CD41/42 và CD41/42 / IVS 1.1. Trong 28 thai nhi được chẩn đoán β-thalassemia, có 6 trường hợp được kết luận mắc β-thalassemia thể nặng. Từ đó cần có sự phối hợp của bác sỹ chuyên khoa huyết học, chuyên khoa sản và bác sỹ di truyền trong việc tư vấn về di truyền và khả năng biểu hiện bệnh đối với những gia đình này.
Đối với các gia đình có tiền sử đẻ con Thalassemia, việc xác định kiểu đột biến và kiểu gen gây bệnh của bố mẹ và bệnh nhân là bắt buộc đối với chẩn đoán trước sinh các lần sinh con tiếp theo. Chúng tôi đã tiến hành chẩn đoán trước sinh cho 3 gia đình có tiền sử đẻ con mắc HbH thì cả 3 trường hợp thai nhi đều được xác định là người lành mang gen bệnh. Đối với 8 gia đình có tiền sử đẻ con β-thalassemia thể nặng, có 4 trường hợp thai nhi được kết luận mắc β-thalassemia thể nặng (1 trường hợp đồng hợp tử 1 đột biến và 3 trường hợp dị hợp tử kép 2 đột biến), 3 thai nhi có kiểu gen dị hợp tử 1 đột biến (là người lành mang gen bệnh) và 1 thai nhi không phát hiện thấy đột biến (là người bình thường không mang gen bệnh). Đối với những gia đình có tiền sử đẻ con mắc bệnh Thalassemia, việc chẩn đoán trước sinh cho những lần mang thai sau có ý nghĩa vô cùng to lớn, giúp giảm bớt gánh nặng cho gia đình bệnh nhân không những về kinh tế, sức khỏe mà còn cả tâm lý.