Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu
2.4.1. Lấy mẫu dịch ối
Các trường hợp có chỉ định chọc hút dịch ối để chẩn đoán trước sinh Thalassemia được tiến hành chọc hút dịch ối khi thai ≥ 16 tuần. Lấy mẫu dịch ối qua thành bụng thai phụ, dưới sự hướng dẫn của siêu âm, đảm bảo nguyên tắc vô trùng.
14 mẫu 78 mẫu Xác định đột biến gen bằng ARMS-PCR/gap-PCR Xác định đột biến gen bằng Reverse hybridization Xác định đột biến gen bằng Reverse hybirdization
Đánh giá giá trị của Reverse hybridization
Tư vấn di truyền Nhận xét về các loại
đột biến và tỷ lệ
So sánh với siêu âm thai và sau đẻ So sánh kết quả 2
phương pháp
Cặp vợ chồng có nguy cơ cao đẻ con Thalassemia
Tiền sử đẻ con được chẩn đoán Thalassemia
Tư vấn, chọc hút dịch ối 92 mẫu
(64 mẫu sàng lọc α-thalassemia, 28 mẫu sàng lọc β-thalassemia)
Lượng dịch ối lấy khoảng 1,5 ÷ 2 ml, thực hiện xét nghiệm để xác định đột biến.
Dịch ối bình thường có màu vàng chanh và hơi đục (phụ thuộc vào độ đậm của tế bào). Dịch ối được đựng trong những tuýp vô trùng có nắp đậy.
Trường hợp mẫu dịch ối có lẫn máu (sau khi ly tâm): mẫu dịch ối sẽ được nuôi cấy trong vòng 7-10 ngày để loại trừ hết máu, sau đó mới tiến hành xét nghiệm. Trong trường hợp này, sau khi lấy mẫu dịch ối, không bảo quản dịch ối ở trong đá hoặc ở nhiệt độ quá thấp sẽ làm tế bào bị chết, không nuôi cấy được.
2.4.2. Xác định đột biến
Các mẫu ối trong nghiên cứu được chia làm 2 nhóm:
- Nhóm 1 gồm 78 mẫu: được xác định đột biến bằng 1 phương pháp Reverse hybridization (sử dụng kit α-globin StripAssay hoặc β- globin StripAssay SEA).
- Nhóm 2 gồm 14 mẫu: được xác định đột biến bằng cả 2 phương pháp: Reverse hybridization và ARMS-PCR/gap-PCR.
2.4.2.1.Xác định đột biến bằng α-globin StripAssay hoặc β-globin StripAssay SEA
* Xác định đột biến với α-globin StripAssay
- Tách chiết DNA: DNA được tách từ mẫu dịch ối bằng kit của hãng Zymo
Quick gDNA miniprep, đảm bảo lượng DNA từ 2 ÷ 10 ng/μl ( tương đương 10 ÷ 50 ng DNA cho 1 phản ứng)
- Thực hiện phản ứng PCR
+ Chuẩn bị dung dịch Taq DNA Polymerase nồng độ 0,33U/μl (pha loãng trong Taq Dilution Buffer 1:15).
+ Chuẩn bị 3 tuýp phản ứng cho mỗi mẫu, đặt tuýp trong đá. + Mix 3 tuýp/ mẫu (trên đá)
A1 A2 B 15µl Amplification MixA1 5µl Tag DNA polymerase 5µl DNA 15µl Amplification MixA2 5µl Tag DNA polymerase 5µl DNA 15µl Amplification MixA3 5µl Tag DNA polymeras 5µl DNA + Chạy PCR theo chu trình đã được thiết lập sẵn cho α-thalassemia:
· 95°C/5 phút
· 97°C/40 giây – 64°C/40 giây – 72°C/1:30 phút (3 chu kỳ) · 97°C/40 giây – 58°C/40 giây –72°C/1:30 phút (37 chu kỳ) · 72°C/5 phút
+ Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 3%
·Mix A1 (chứa các đoạn dò cho toàn bộ gen α1 và đột biến --α3.7): sản phẩm PCR ở vị trí 881bp (có thể có: 1783bp).
·Mix A2 (chứa các đoạn dò cho các đột biến --SEA, --THAI, --FIL, -α4.2, -α3.7): sản phẩm PCR ở vị trí 296bp (có thể: 250bp, 329bp, 373bp, 474bp, 578bp, 1025bp).
·Mix B (chứa đoạn dò cho toàn bộ gen α2 và đột biến –αanti3.7): sản phẩm PCR ở vị trí 302bp, 864bp (có thể: 1772bp).
- Lai 2 teststrip/mẫu (45°C, máy ủ lắc)
+ Đặt nhiệt độ máy ủ lắc 45°C.
+ Làm ấm dung dịch Hybridization Buffer và Wash Solution A đến 45°C. + Để Teststrip, DNAT, Conjungate Solution, Wash Solution B và Color Developer ở nhiệt độ phòng.
+ Chuẩn bị khay lai, 2 giếng/ mẫu:
Với giếng Teststrip A: mix 20μl DNAT
10μl sản phẩm khuếch đại A1 10μl sản phẩm khuếch đại A2
Với giếng Teststrip B: mix 10μl DNAT
10μl sản phẩm khuếch đại B + Để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Thêm 1ml Hybridization buffer (đã được làm ấm 45°C) vào mỗi giếng, đảo nhẹ. + Đặt thanh Teststrip A, B vào 2 giếng tương ứng.
+ Ủ 30 phút ở 45°C trong máy ủ lắc. + Hút hết dịch trong giếng.
- Rửa (45°C, máy ủ lắc)
+ Thêm 1ml Wash Solution A (đã được làm ấm 45°C) vào mỗi giếng, đảo nhẹ khoảng 10 giây, hút bỏ dịch.
+ Thêm 1ml Wash Solution A (đã được làm ấm 45°C). + Ủ 15 phút, 45°C trong máy ủ lắc. Hút hết dịch.
+ Thêm 1ml Wash Solution A (đã được làm ấm 45°C). + Ủ 15 phút ở 45°C trong máy ủ lắc. Hút hết dịch.
- Nhuộm màu (nhiệt độ phòng)
+ Thêm 1ml Conjungate Solution.
+ Ủ 15 phút, nhiệt độ phòng trong máy ủ. Hút hết dịch.
+ Thêm 1ml Wash Solution B, đảo nhẹ khoảng 10 giây, hút bỏ dịch.
+ Thêm 1ml Wash Solution B, ủ 5 phút, nhiệt độ phòng trong máy ủ. Hút hết dịch. + Thêm 1ml Wash Solution B, ủ 5 phút, nhiệt độ phòng trong máy ủ. Hút hết dịch. + Thêm 1ml Color Developer.
+ Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng trong máy ủ (tối). Vạch màu tím sẽ xuất hiện tương ứng phản ứng dương tính.
+ Rửa Teststrip nhiều lần bằng nước cất cất. + Để Teststrip khô trong tối và phân tích kết quả.
Xác định đột biến với β-globin StripAssay SEA
Quy trình thực hiện tương tự như α-globin StripAssay, chỉ khác ở phản ứng PCR. + Chuẩn bị dung dịch Taq DNA Polymerase nồng độ 0,2U/μl (pha loãng trong Taq Dilution Buffer 1:25).
+ Mix PCR: 1tuýp/mẫu
15µl Amplification Mix 5µl Tag DNA polymerase 5µl DNA
+ Chạy PCR theo chu trình đã được thiết lập sẵn cho β-thalassemia: ·94°C/2 phút
·94°C/15 giây – 58°C/30 giây – 72°C/45 giây (35 chu kỳ) ·72°C/3 phút.
+ Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 3%: 310bp, 381bp, 755bp.
Với mỗi vị trí trên Teststrip, kết quả có thể có các trường hợp sau:
Bảng 2.2. Chỉ dẫn cách đánh giá đột biến trên Teststrip
Vạch alen bình thường (Wild type) Vạch đột biến
(Mutant) Kiểu gen
Dương tính Âm tính Bình thường ( NOR)
Dương tính Dương tính Dị hợp tử ( HET)
Hình 2.2. Cách xác định đột biến trên Teststrip
(Vạch mutant CD17 dương tính, vạch wild type CD17 âm tính
2.4.2.2. Xác định đột biến thalassemia bằng phương pháp multiplex gap - PCR và ARMS - PCR
- Tách chiết DNA: DNA được tách từ mẫu dịch ối bằng kit của hãng Quiagen, đảm bảo lượng DNA từ 100 ng/μl ( tương đương 100ng DNA cho 1 phản ứng)
- Các bước sàng lọc đột biến: như bảng 2.3, 2.4
Bảng 2.3. Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen α globin
Bước sàng lọc
Tên đột biến Số gen mất Phương pháp sử dụng 1 --SEA --THAI --FIL -α3.7 -α4.2 2 2 2 1 1 Multiplex-PCR 2 HbQs HbCs 1 1 C-ARMS-PCR
Bảng 2.4. Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen β globin
Bước sàng lọc Loại đột biến Mồi đặc hiệu Mồi chung
1 Codon 17 Codon 41/42 -28 IVS 1.1 CD17M CD41/42M -28M IVS 1.1M Thal B
2 IVS 1.5 IVS 1.5M Thal B
3 Codon 71/72 CD71/72M Thal C
4 IVS 2.654 IVS 2.654M Thal F
5 Codon 26 HbE-M BT-B
2.4.3. Đánh giá giá trị của phương pháp lai phân tử ngược
- Phân tích đột biến đồng thời bằng hai phương pháp: phương pháp lai phân tử ngược và phương pháp đang tiến hành (Multiplex gap-PCR, ARMS-PCR) - Phân tích, đánh giá, so sánh kết quả các đột biến của bố mẹ và thai (nếu có)