3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3.Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các yếu tố vật lí như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định.
+ Ánh sáng: Các mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn Neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 – 12 giờ/ngày.
+ Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng nuôi cấy được duy trì trong khoảng 25 ± 20
C. + Độ ẩm: Phòng nuôi cấy có độ ẩm khoảng 70%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 26
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm Cytokinin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm
Nhân nhanh chồi là giai đoạn gia tăng số lượng chồi trong một thời gian ngắn. Đây là giai đoạn quan trọng quyết định số lượng cây trong quá trình nuôi cấy in vitro. Hệ số nhân chồi càng cao thì khả năng nhân giống càng lớn. Hệ số nhân chồi chịu ảnh hưởng lớn của yếu tố tác động là các chất kích thích sinh trưởng. Mục tiêu nghiên cứu của giai đoạn này là tìm ra môi trường phù hợp để có hệ số nhân chồi và chất lượng chồi là tốt nhất cho đối tượng nghiên cứu. Trong môi trường nền, chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin được bổ sung riêng rẽ hoặc bổ sung kết hợp với một số chất thuộc nhóm auxin ở nồng độ thích hợp cho đối tượng nghiên cứu sẽ giúp thu được số chồi/mẫu cao và chất lượng chồi tốt.
Với mục đích nhân nhanh chồi, trước hết chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP, kinetin (thuộc nhóm cytokinin) đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây.
3.1.1. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm
Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, BAP thường được sử dụng với nồng độ thay đổi từ 0,2 – 1,0 mg/l. Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém dẫn đến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm. Chúng tôi thăm dò nồng độ BAP từ 0,2 mg/l đến 1,0 mg/l cho khả năng nhân chồi và sinh trưởng của chồi cây Sâm dây và thu được kết quả như bảng 3.1 dưới đây:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 27
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của
chồi Sâm dây (sau 4 tuần và 8 tuần) Công
thức
Nồng độ BAP
(mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần 1 (ĐC) 0 1,33 ± 0,60 1,41 ± 0,08 + 2 0,2 3,50 ± 0,37 1,71 ± 0,19 ++ 3 0,4 4,00 ± 0,82 2,41 ± 0,14 +++ 4 0,6 4,66 ± 0,28 2,35 ± 0,28 +++ 5 0,8 2,83 ± 0,40 2,00 ± 0,20 ++ 6 1,0 2,50 ± 0,47 1,73 ± 0,15 ++ Sau 8 tuần 1 (ĐC) 0 1,58 ± 0,14 1,95 ± 0,13 + 2 0,2 4,33 ± 0,44 4,00± 0,16 ++ 3 0,4 4,50 ± 0,37 4,55 ± 0,36 +++ 4 0,6 5,33 ± 0,41 4,08 ± 0,11 +++ 5 0,8 3,16 ± 0,19 3,83 ± 0,21 ++ 6 1,0 3,33 ± 0,31 2,66 ± 0,13 +
(Ghi chú: Chồi tốt: +++, Chồi trung bình: ++, Chồi kém: +)
BAP 0,2 mg/l BAP 0,6 mg/l BAP 1,0 mg/l
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng
của chồi Sâm dây (sau 8 tuần)
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, các công thức có bổ sung BAP cho khả năng nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng (công thức 1) không bổ sung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 28 BAP. Công thức 1 cho số chồi/mẫu đạt 1,33 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 1,58 (sau 8 tuần nuôi cấy). Các công thức thí nghiệm còn lại cho số chồi/mẫu đạt từ 2,50 đến 4,66 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 3,33 – 5,33 (sau 8 tuần nuôi cấy). Trong đó, công thức 4 bổ sung BAP với nồng độ 0,6 mg/l cho số chồi/mẫu cao nhất là 4,66 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 5,33 (sau 8 tuần nuôi cấy). Các công thức thí nghiệm 2 - 3 - 5 - 6 cho số chồi/mẫu lần lượt là 3,50 - 4,00 - 2,83 - 2,50 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 4,33 - 4,50 - 3,16 - 3,33 (sau 8 tuần nuôi cấy). Khi nồng độ BAP qua ngưỡng cao nhất ở công thức 4 thì hệ số nhân chồi có xu hướng giảm dần ở công thức 5 và 6.
Kết quả bảng 3.1 còn cho thấy, khi bổ sung BAP thì chiều cao chồi tăng so với công thức đối chứng (không bổ sung BAP). Chiều cao chồi tăng lần lượt 1,71 - 1,73 cm - 2,00 cm - 2,35 cm - 2,41 cm tương ứng với các công thức 2 - 6 - 5 - 4 - 3 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 2,66 cm - 3,83 cm - 4,00 cm - 4,08 cm - 4,55 cm tương ứng với các công thức 6 - 5 - 2 - 4 - 3 (sau 8 tuần nuôi cấy) trong khi công thức đối chứng chồi đạt chiều cao là 1,41 cm (sau 4 tuần nuôi cấy) và 1,95 cm (sau 8 tuần nuôi cấy). Như vậy nếu xét về chiều cao chồi thì công thức 3 là tối ưu nhất.
Chất lượng chồi ở thí nghiệm được đánh giá từ mức kém đến mức tốt. Trong đó, công thức 6 (nồng độ BAP là 1mg/l) có chất lượng chồi không khác biệt nhiều so với công thức 1 (công thức đối chứng - không bổ sung BAP); công thức 2 và 5 (nồng độ BAP là 0,2 mg/l và 0,8mg/l ) cho chồi chất lượng cao hơn đối chứng và được đánh giá ở mức trung bình; công thức 3 và 4 (nồng độ BAP là 0,4 mg/l và 0,6 mg/l ) cho chất lượng chồi đánh giá ở mức tốt.
Nếu xét đồng thời các chỉ tiêu số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi thì chỉ tiêu số chồi/mẫu được coi là ưu tiên trong giai đoạn nhân nhanh. Do đó có thể kết luận: công thức 4 (bổ sung BAP 0,6 mg/l vào môi trường nền MS + đường 25 g/l + agar 8,5 g/l + nước dừa 50 ml/l) là thích hợp nhất trong thí nghiệm, cho số chồi/mẫu đạt 4,66 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 5,33 (sau 8 tuần nuôi cấy), sự sinh trưởng của chồi đảm bảo, chất lượng chồi tốt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 29 Công thức bổ sung BAP nồng độ 0,6 mg/l vào môi trường nền được chọn để sử dụng trong nghiên cứu các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo (BAP kết hợp IBA).
3.1.2. Ảnh hƣởng của kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm
Kinetin là một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để làm tăng hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi, [9]. Chúng tôi tham khảo các tài liệu về nhân giống vô tính thì nồng độ kinetin từ 0,1 mg/l đến 1,0 mg/l là thích hợp cho sự nhân chồi và sinh trưởng của chồi [7], [11], [19],…. Từ đó chúng tôi thăm dò nồng độ kinetin từ 0,1 mg/l đến 0,5 mg/l cho khả năng nhân chồi và sinh trưởng của chồi cây Sâm dây và thu được kết quả như bảng 3.2 dưới đây:
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng
của chồi Sâm dây (sau 4 tuần và 8 tuần) Công
thức
Nồng độ
Kinetin (mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần 1 (ĐC) 0 1,33 ± 0,60 1,41 ± 0,08 + 2 0,1 3,16 ± 0,16 2,66 ± 0,35 ++ 3 0,2 3,83 ± 0,15 2,83 ± 0,41 +++ 4 0,3 4,50 ± 0,27 3,58 ± 0,19 +++ 5 0,4 2,83 ± 0,21 2,16 ± 0,16 ++ 6 0,5 2,16 ± 0,35 1,90 ± 0,21 + Sau 8 tuần 1 (ĐC) 0 1,58 ± 0,14 1,95 ± 0,13 + 2 0,1 3,66 ± 0,60 4,25± 0,32 ++ 3 0,2 4,16 ± 0,19 4,41± 0,32 +++ 4 0,3 4,66± 0,21 6,66 ± 0,57 +++ 5 0,4 2,83 ± 0,15 3,83 ± 0,32 ++ 6 0,5 1,58 ± 0,14 1,95 ± 0,13 +
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 30 Sau 4 tuần và sau 8 tuần nuôi cấy dữ liệu tại bảng 3.2 cho thấy các công thức có bổ sung kinetin cho khả năng nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng (công thức 1) không bổ sung kinetin. Khi bổ sung kinetin với nồng độ 0,3 mg/l ở công thức 4 cho số chồi/mẫu cao nhất đạt 4,50 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 4,66 (sau 8 tuần nuôi cấy), sai khác có ý nghĩa so với đối chứng. Số chồi/mẫu tăng dần từ nồng độ 0,1; 0,2 đến 0,3mg/l và giảm dần từ nồng độ 0,3; 0,4 đến 0,5. Về chiều cao của chồi công thức 4 có giá trị lớn nhất đạt 3,58 cm (sau 4 tuần nuôi cấy) và 6,66 cm (sau 8 tuần nuôi cấy). Các nồng độ còn lại có sự tăng dần từ các nồng độ 0,1; 0,2; 0,3 mg/l và giảm dần từ các nồng độ 0,3; 0,4; 0,5 mg/l theo bảng 3.2.
Kết hợp các chỉ tiêu về số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi có thể đi đến kết luận: công thức 4 có bổ sung 0,3 mg/l kinetin vào môi trường nền MS + đường 25 g/l + agar 8,5 g/l + nước dừa 50ml/l là thích hợp nhất trong thí nghiệm, cho số chồi/mẫu đạt 4,50 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 4,66 (sau 8 tuần nuôi cấy), chồi hơi cao, chất lượng chồi tốt. Do đó công thức bổ sung kinetin nồng độ 0,3 mg/l vào môi trường nền được chọn để sử dụng trong nghiên cứu các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo.
Kinetin 0,1 mg/l Kinetin 0,3 mg/l Kinetin 0,5 mg/l
Hình 3.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng
của chồi Sâm dây (sau 8 tuần)
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây trong ống nghiệm
IBA (3-indolebutyric axit) là một chất kích thích thuộc nhóm auxin có tác dụng kích thích sự phát triển rễ thực vật. Sâm dây cao khoảng 4 - 5 cm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 31 được cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 25g đường, 8,5g thạch aga và IBA (0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l). Chúng tôi đã tiến hành thăm dò ảnh hưởng của IBA lên sự phát sinh rễ của Sâm dây và thu được kết quả theo bảng số liệu dưới đây.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây
(sau 8 tuần) Công thức Nồng độ IBA (mg/l) Tỉ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ /cây Chất lượng rễ 1 (ĐC) 0,0 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 - 2 0,2 68,33 ± 4,40 4,50 ± 0,51 ++ 3 0,4 76,66 ± 4,40 5,73 ± 0,89 +++ 4 0,6 86,66 ± 1,66 7,30 ± 0,36 +++ 5 0,8 71,66 ± 3,33 4,70 ± 0,96 ++
(-): Không ra rễ; (+): Rễ xấu; (++): Rễ bình thường; (+++): Rễ đẹp
Kết quả thu được ở bảng 3.3 cho thấy, các công thức thí nghiệm có bổ sung IBA với nồng độ từ 0,2mg/l - 0,4 mg/l - 0,6mg/l - 0,8mg/l đều có sự ra rễ với các mức độ phát triển khác nhau. Ở công thức đối chứng thì không phát sinh rễ. Bổ sung IBA 0,6 mg/l cho rễ đẹp và số lượng rễ nhiều nhất đạt 7,30 rễ/cây sau 8 tuần nuôi cấy. Còn ở các công thức môi trường khác có phát sinh rễ nhưng rễ bình thường hoặc rễ xấu và số lượng rễ chênh lệch nhiều giữa các mô trong cùng một môi trường. Như vậy, môi trường thích hợp nhất cho sự tạo rễ của chồi Sâm dây là MS + 25g đường + 8,5g aga + IBA 0,6mg/ + nước dừa 50ml/l.
Không bổ sung IBA Bổ sung IBA 0,4 mg/l Bổ sung IBA 0,6 mg/l
Hình 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 32 Qua nghiên cứu ảnh hưởng của IBA, chúng tôi nhận thấy IBA có tác động đến khả năng tạo rễ và số rễ/cây. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng vì rễ cây Sâm dây là bộ phận chủ yếu dùng làm thuốc trong y học.
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp giữa các chất thuộc nhóm Cytokinin với IBA đến hiệu quả nhân chồi, sự sinh trƣởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm
Chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng của môi trường tổ hợp BAP +IBA , tổ hợp kinetin + IBA, tổ hợp BAP + kinetin + IBA đến khả năng tạo chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây. Dựa trên cơ sở các kết quả của việc nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng, chúng tôi lựa chọn sự kết hợp ở các nồng độ khác nhau của các chất kích thích sinh trưởng. Sau 8 tuần chúng tôi đánh giá khả năng tạo chồi thông qua hệ số nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi.
3.3.1. Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trƣởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm
Trên cơ sở nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của từng chất kích thích sinh trưởng chúng tôi nhận thấy BAP nồng độ 0,6 mg/l ảnh hưởng mạnh nhất đến khả năng nhân chồi, sinh trưởng của chồi và IBA nồng độ 0,6 mg/l ảnh hưởng mạnh nhất đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây. Từ đó chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng kết hợp của BAP nồng độ 0,6 mg/l với IBA có nồng độ thay đổi 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l. Kết quả thu được theo bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến khả năng nhân chồi, sự
sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l)
Số chồi/mẫu Chiều cao
chồi (cm) Số rễ/ cây Chất lượng chồi 1 (ĐC) 0,6 0 5,33 ± 0,41 4,08 ± 0,11 0 ++ 2 0,6 0,4 5,33 ± 0,33 4,33 ± 0,24 6,95 ± 0,44 +++ 3 0,6 0,6 5,50 ± 0,61 4,25 ± 0,38 7,80 ± 0,67 +++ 4 0,6 0,8 4,83 ± 0,47 3,83 ± 0,33 4,57 ± 0,65 ++
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 33 Qua bảng 3.4 nhận thấy, khi thay đổi nồng độ IBA từ 0,4 mg/l lên 0,8 mg/l và giữ nguyên nồng độ BAP 0,6 mg/l trong môi trường nuôi cấy thì số chồi/mẫu lần lượt là 5,33; 5,50; 4,83 và chiều cao chồi lần lượt là 4,33 cm, 4,25 cm, 3,83 cm. Công thức 2 có số chồi/mẫu sai khác không có ý nghĩa nhưng chiều cao chồi sai khác nhiều nhất với công thức đối chứng. Công thức 3 có số chồi/mẫu và chiều cao chồi đều sai khác có ý nghĩa so với đối chứng và cho hệ số nhân chồi cao nhất trong thí nghiệm. Số rễ/cây của công thức 3 cho tỉ lệ cao nhất đạt 7,80 cao hơn so với công thức 2 và 4 lần lượt là 6,95 và 4,57. Chất lượng chồi trong các công thức đều tốt. Như vậy có thể kết luận: Công thức 3 với việc bổ sung 0,6 mg/l BAP và 0,6 mg/l IBA vào môi trường nền MS + đường 25 g/l + agar 8,5 g/l + nước dừa 50ml/l là thích hợp nhất trong thí nghiệm, cho số chồi/mẫu đạt 5,5; chiều cao chồi đạt 4,25 cm; số rễ/ cây đạt 7,80 và chất lượng chồi tốt.
IBA 0,4mg/l IBA 0,6 mg/l IBA 0,8 mg/l
Hình 3.4. Ảnh hưởng kết hợp của BAP và IBA đến khả năng nhân chồi và sự
sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần)
3.3.2. Ảnh hƣởng kết hợp giữa Kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trƣởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng và tạo rễ cây Sâm dây, kết quả được thể hiện ở bảng 3.5 và hình 3.5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 34
Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp giữa Kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi,
sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) Công thức Nồng độ Kinetin (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Số rễ/ cây Chất lượng chồi 1 (ĐC) 0,3 0 4,66 ± 0,21 6,66 ± 0,57 0,00 ± 0,00 + 2 0,3 0,4 4,83 ± 0,15 6,91 ± 0,18 6,57 ± 0,46 +++ 3 0,3 0,6 5,16 ± 0,17 6,50 ± 0,52 7,25 ± 0,46 +++ 4 0,3 0,8 4,50 ± 0,35 6,41 ± 0,65 4,83 ± 1,01 ++
(Ghi chú: Chồi tốt: +++, Chồi trung bình: ++, Chồi kém: +)
Qua bảng 3.5 nhận thấy, khi thay đổi nồng độ IBA từ 0,4 mg/l lên 0,8 mg/l và giữ nguyên nồng độ kinetin 0,3 mg/l trong môi trường nuôi cấy thì số