3. Nội dung nghiên cứu
2.1.Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Sử dụng cây Sâm dây đã được khử trùng sạch bệnh do Trại thực nghiệm sinh học Cổ Nhuế - Từ Liêm – Hà Nội cung cấp.
2.1.2. Hoá chất, thiết bị
Hoá chất
Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) [26].
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc như các chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin, NAA, IBA, nước dừa, đường sucrose, thạch, ethanol, NaOH…
Thiết bị
Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, pipet, cốc thủy tinh định mức, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm. Bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ), nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy (Nhật), tủ sấy (Carbolite, Anh), máy đo pH, cân kĩ thuật, cân phân tích, bếp điện....
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào - Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
Sử dụng các đoạn thân mang chồi nách của các cây Sâm dây mẫu làm vật liệu cấy trên môi trường nhân nhanh. Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân nhanh và tạo rễ cây Sâm dây, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy. Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 22 nền môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 25 g/l + agar 8,5 g/l + nước dừa 50 ml/l và chất kích thích sinh trưởng có nồng độ thay đổi. Đối chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung kích thích sinh trưởng. Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Mỗi công thức nuôi cấy 30 mô, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy.
(1) Nghiên cứu sự ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin lên khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm
Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ BAP, kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi: Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường nhân chồi bổ sung BAP với các nồng độ: 0,2 mg; 0,4 mg; 0,6 mg; 0,8 mg; 1 mg cho 1 lít môi trường hoặc kinetin với các nồng độ: 0,1 mg; 0,2 mg; 0,3 mg; 0,4 mg; 0,5 mg cho 1 lít môi trường.
Đối với hai loại kích thích sinh trưởng này, chúng tôi theo dõi sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy bằng các chỉ số sau:
+ Số chồi/mẫu.
+ Chiều cao của chồi. + Chất lượng chồi:
Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh
Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh
Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng (2) Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây trong ống nghiệm
Sử dụng chồi Sâm dây sinh trưởng tốt được tạo ra trên môi trường bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin có chiều cao 4 – 5 cm, được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ có bổ sung IBA với các nồng độ: 0,2 mg; 0,4 mg; 0,6 mg; 0,8 mg cho 1 lít môi trường.
Kết quả được đánh giá sau 8 tuần bằng cách theo dõi các chỉ số: + Tỉ lệ chồi ra rễ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 23 + Số rễ/chồi.
+ Chất lượng rễ:
Rễ tốt: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng
Rễ trung bình: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu trắng. Rễ kém: Bề mặt rễ sùi, rễ xốp, màu trắng.
(3) Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin với IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng ra rễ của cây Sâm dây trong ống nghiệm
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng sự tác động của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng BAP + IBA, kinetin + IBA và BAP + kinetin + IBA đến hệ số nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi. Chúng tôi thực hiện cấy lên môi trường bổ sung tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP + IBA, kinetin + IBA, BAP + kinetin + IBA và theo dõi kết quả thí nghiệm sau 8 tuần qua các chỉ số sau:
+ Số chồi/mẫu.
+ Chiều cao của chồi. + Chất lượng chồi. + Tỉ lệ chồi ra rễ + Số rễ/cây + Chất lượng rễ
(4) Nghiên cứu giá thể và các điều kiện thích hợp để dưa cây ra môi trường tự nhiên
Vật liệu là cây Sâm dây sau nuôi cấy mô. Chọn cây có bộ rễ dài, khỏe, lá xanh, đang thời kì sung sức để đưa ra môi trường tự nhiên.
Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên, thường tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài bằng cách đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên, không cho ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây. Thời gian này kéo dài khoảng 7 – 10 ngày, tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 24 thích nghi của cây. Sau đó, các bình cây được mở nắp, đổ nước vào ngâm 15 phút, lắc nhẹ để thạch rời ra khỏi rễ, dùng panh gắp nhẹ các cây ra khỏi bình không để dập nát. Rửa sạch phần thạch và đường bám vào vì chúng thường là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công. Sau đó, ngâm cây trong chậu nước sạch để tránh hiện tượng mất nước rồi đem trồng vào giá thể.
Tạo bầu cấy cây: Dùng bầu nhựa PE có đường kính 5,5 cm, cao 11 cm, có đục lỗ dưới đáy. Thành phần ruột bầu chính là các loại giá thể (1)Đất thịt trung bình; (2) Đất thịt trung bình + cát (2:1); (3) Đất thịt trung bình + cát + xơ dừa đã xử lý + phân chuồng hoai theo tỉ lệ 2:1:2:1 bổ sung 5% NPK và 2% vôi bột
Xử lí bầu: Trước khi cấy 1 – 2 ngày, bầu đất được xử lí khử trùng nấm bệnh bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hòa thuốc tím vào nước và dùng ô doa tưới lên bề mặt bầu cho thấm sâu 2 – 3 cm.
Chế độ chăm sóc cây con trong giá thể: Trong 2 – 3 ngày đầu tưới nước sạch bằng cách phun sương 4 lần/ngày (giữ độ ẩm giá thể khoảng 75% - 80%). Trời rét phải che nilon tránh rét và tránh thoát nước nhanh. Nilon phải đục lỗ thoáng khí. Sau 3 ngày có thể bỏ nilon che, để cây nơi đủ ánh sáng, thoáng khí, tránh nắng, mưa trực tiếp. Tưới nước bằng bình phun 2 - 3 lần/ngày. Sau 10 ngày tưới cây bằng dung dịch MS pha loãng với tỉ lệ 1/10, ngày 1 lần. Sau khi cây sống, ra rễ mới, lá mới là có thể đưa ra đồng ruộng.
Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 60 cây/công thức.
Đánh giá kết quả sau khi ra cây 30 ngày. Theo dõi các chỉ số sau: + Tỉ lệ cây sống.
+ Chiều cao cây.
2.2.2. Phƣơng pháp xử lí và tính toán số liệu
Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình mẫu với n ≥ 30, α = 0,05.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 25 Các số liệu được xử lí trên máy vi tính bằng chương trình Excel [24]. Các phương pháp được sử dụng là phương pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis, phương pháp phân tích phương sai một nhân tố.
2.2.3. Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các yếu tố vật lí như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định.
+ Ánh sáng: Các mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn Neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 – 12 giờ/ngày.
+ Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng nuôi cấy được duy trì trong khoảng 25 ± 20
C. + Độ ẩm: Phòng nuôi cấy có độ ẩm khoảng 70%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 26
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm Cytokinin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm
Nhân nhanh chồi là giai đoạn gia tăng số lượng chồi trong một thời gian ngắn. Đây là giai đoạn quan trọng quyết định số lượng cây trong quá trình nuôi cấy in vitro. Hệ số nhân chồi càng cao thì khả năng nhân giống càng lớn. Hệ số nhân chồi chịu ảnh hưởng lớn của yếu tố tác động là các chất kích thích sinh trưởng. Mục tiêu nghiên cứu của giai đoạn này là tìm ra môi trường phù hợp để có hệ số nhân chồi và chất lượng chồi là tốt nhất cho đối tượng nghiên cứu. Trong môi trường nền, chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin được bổ sung riêng rẽ hoặc bổ sung kết hợp với một số chất thuộc nhóm auxin ở nồng độ thích hợp cho đối tượng nghiên cứu sẽ giúp thu được số chồi/mẫu cao và chất lượng chồi tốt.
Với mục đích nhân nhanh chồi, trước hết chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP, kinetin (thuộc nhóm cytokinin) đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây.
3.1.1. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm
Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, BAP thường được sử dụng với nồng độ thay đổi từ 0,2 – 1,0 mg/l. Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém dẫn đến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm. Chúng tôi thăm dò nồng độ BAP từ 0,2 mg/l đến 1,0 mg/l cho khả năng nhân chồi và sinh trưởng của chồi cây Sâm dây và thu được kết quả như bảng 3.1 dưới đây:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 27
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của
chồi Sâm dây (sau 4 tuần và 8 tuần) Công
thức
Nồng độ BAP
(mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần 1 (ĐC) 0 1,33 ± 0,60 1,41 ± 0,08 + 2 0,2 3,50 ± 0,37 1,71 ± 0,19 ++ 3 0,4 4,00 ± 0,82 2,41 ± 0,14 +++ 4 0,6 4,66 ± 0,28 2,35 ± 0,28 +++ 5 0,8 2,83 ± 0,40 2,00 ± 0,20 ++ 6 1,0 2,50 ± 0,47 1,73 ± 0,15 ++ Sau 8 tuần 1 (ĐC) 0 1,58 ± 0,14 1,95 ± 0,13 + 2 0,2 4,33 ± 0,44 4,00± 0,16 ++ 3 0,4 4,50 ± 0,37 4,55 ± 0,36 +++ 4 0,6 5,33 ± 0,41 4,08 ± 0,11 +++ 5 0,8 3,16 ± 0,19 3,83 ± 0,21 ++ 6 1,0 3,33 ± 0,31 2,66 ± 0,13 +
(Ghi chú: Chồi tốt: +++, Chồi trung bình: ++, Chồi kém: +)
BAP 0,2 mg/l BAP 0,6 mg/l BAP 1,0 mg/l
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng
của chồi Sâm dây (sau 8 tuần)
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, các công thức có bổ sung BAP cho khả năng nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng (công thức 1) không bổ sung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 28 BAP. Công thức 1 cho số chồi/mẫu đạt 1,33 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 1,58 (sau 8 tuần nuôi cấy). Các công thức thí nghiệm còn lại cho số chồi/mẫu đạt từ 2,50 đến 4,66 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 3,33 – 5,33 (sau 8 tuần nuôi cấy). Trong đó, công thức 4 bổ sung BAP với nồng độ 0,6 mg/l cho số chồi/mẫu cao nhất là 4,66 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 5,33 (sau 8 tuần nuôi cấy). Các công thức thí nghiệm 2 - 3 - 5 - 6 cho số chồi/mẫu lần lượt là 3,50 - 4,00 - 2,83 - 2,50 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 4,33 - 4,50 - 3,16 - 3,33 (sau 8 tuần nuôi cấy). Khi nồng độ BAP qua ngưỡng cao nhất ở công thức 4 thì hệ số nhân chồi có xu hướng giảm dần ở công thức 5 và 6.
Kết quả bảng 3.1 còn cho thấy, khi bổ sung BAP thì chiều cao chồi tăng so với công thức đối chứng (không bổ sung BAP). Chiều cao chồi tăng lần lượt 1,71 - 1,73 cm - 2,00 cm - 2,35 cm - 2,41 cm tương ứng với các công thức 2 - 6 - 5 - 4 - 3 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 2,66 cm - 3,83 cm - 4,00 cm - 4,08 cm - 4,55 cm tương ứng với các công thức 6 - 5 - 2 - 4 - 3 (sau 8 tuần nuôi cấy) trong khi công thức đối chứng chồi đạt chiều cao là 1,41 cm (sau 4 tuần nuôi cấy) và 1,95 cm (sau 8 tuần nuôi cấy). Như vậy nếu xét về chiều cao chồi thì công thức 3 là tối ưu nhất.
Chất lượng chồi ở thí nghiệm được đánh giá từ mức kém đến mức tốt. Trong đó, công thức 6 (nồng độ BAP là 1mg/l) có chất lượng chồi không khác biệt nhiều so với công thức 1 (công thức đối chứng - không bổ sung BAP); công thức 2 và 5 (nồng độ BAP là 0,2 mg/l và 0,8mg/l ) cho chồi chất lượng cao hơn đối chứng và được đánh giá ở mức trung bình; công thức 3 và 4 (nồng độ BAP là 0,4 mg/l và 0,6 mg/l ) cho chất lượng chồi đánh giá ở mức tốt.
Nếu xét đồng thời các chỉ tiêu số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi thì chỉ tiêu số chồi/mẫu được coi là ưu tiên trong giai đoạn nhân nhanh. Do đó có thể kết luận: công thức 4 (bổ sung BAP 0,6 mg/l vào môi trường nền MS + đường 25 g/l + agar 8,5 g/l + nước dừa 50 ml/l) là thích hợp nhất trong thí nghiệm, cho số chồi/mẫu đạt 4,66 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 5,33 (sau 8 tuần nuôi cấy), sự sinh trưởng của chồi đảm bảo, chất lượng chồi tốt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 29 Công thức bổ sung BAP nồng độ 0,6 mg/l vào môi trường nền được chọn để sử dụng trong nghiên cứu các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo (BAP kết hợp IBA).
3.1.2. Ảnh hƣởng của kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm
Kinetin là một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để làm tăng hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi, [9]. Chúng tôi tham khảo các tài liệu về nhân giống vô tính thì nồng độ kinetin từ 0,1 mg/l đến 1,0 mg/l là thích hợp cho sự nhân chồi và sinh trưởng của chồi [7], [11], [19],…. Từ đó chúng tôi thăm dò nồng độ kinetin từ 0,1 mg/l đến 0,5 mg/l cho khả năng nhân chồi và sinh trưởng của chồi cây Sâm dây và thu được kết quả như bảng 3.2 dưới đây:
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng
của chồi Sâm dây (sau 4 tuần và 8 tuần) Công
thức
Nồng độ
Kinetin (mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần 1 (ĐC) 0 1,33 ± 0,60 1,41 ± 0,08 + 2 0,1 3,16 ± 0,16 2,66 ± 0,35 ++ 3 0,2 3,83 ± 0,15 2,83 ± 0,41 +++ 4 0,3 4,50 ± 0,27 3,58 ± 0,19 +++ 5 0,4 2,83 ± 0,21 2,16 ± 0,16 ++ 6 0,5 2,16 ± 0,35 1,90 ± 0,21 + Sau 8 tuần 1 (ĐC) 0 1,58 ± 0,14 1,95 ± 0,13 + 2 0,1 3,66 ± 0,60 4,25± 0,32 ++ 3 0,2 4,16 ± 0,19 4,41± 0,32 +++ 4 0,3 4,66± 0,21 6,66 ± 0,57 +++ 5 0,4 2,83 ± 0,15 3,83 ± 0,32 ++ 6 0,5 1,58 ± 0,14 1,95 ± 0,13 +
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 30 Sau 4 tuần và sau 8 tuần nuôi cấy dữ liệu tại bảng 3.2 cho thấy các công thức có bổ sung kinetin cho khả năng nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng (công thức 1) không bổ sung kinetin. Khi bổ sung kinetin với nồng độ 0,3 mg/l ở công thức 4 cho số chồi/mẫu cao nhất đạt 4,50 (sau 4 tuần nuôi cấy) và 4,66 (sau 8 tuần nuôi cấy), sai khác có ý nghĩa so với đối chứng. Số chồi/mẫu tăng dần từ nồng độ 0,1; 0,2 đến 0,3mg/l và giảm dần từ nồng độ 0,3; 0,4 đến 0,5. Về chiều cao của chồi công thức 4 có giá trị lớn nhất đạt 3,58 cm