Sản phẩm FT2 thô (m= 3.92 g) sau khi tách sắc kí được đem đi cô kiệt loại bỏ hết dung môi etylaxetat. Sau đó EC được đem đi kết tinh lại trong dung dịch axít citric 0,5 % ở nồng độ quá bão hòa ~ 1,5 g/ml. Thời gian để kết tinh lại là qua đêm.
Dung dịch sau khi kết tinh lại ta đem cô cạn dung môi, chấm dịch sau khi cô cạn và so sánh với vệt EC sạch và thấy rằng vẫn còn tạp chất trong dịch FT2. Chúng tôi tiếp tục kết tinh lần thứ hai với quy trình nhưở trên. Lần này chúng tôi chấm và so sánh với vệt EC sạch thì thấy dịch FT2 ( EC) đã sạch tạp chất.
Đem cô kiệt dịch FT2 (EC) đã sạch tạp chất này ta thu được tinh thể, đem cân được khối lượng m = 3.52 g.
Mẫu FT2 (EC) sạch này sau đó được đem đi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMRS tại viện Khoa học và công nghệ Việt Nam để xác định cấu trúc cấu tạo của EC.
3.3.2 Kết quả phân tích cấu trúc FT2 ( EC) bằng NMR
Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân của FT2 (EC) ta có các phổ 1H và 13C NMR như hình 3.8 a và 3.8 b.
Trên phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC ( phụ lục 2) của EC ta thấy có sự tương tác gần giữa C-2 ( 78,07 ppm) với H-2 (4,74 ppm), giữa C-3 ( 64,95 ppm) với H-3 ( 4,01 ppm), giữa C-6 ( 95,13 ppm) với H-6 ( 5,89 ppm), giữa C-8 (94,13 ppm) với H-8 ( 5,89 ppm), giữa C-5‘ (114,78 ppm) với H-5‘ ( 6,66 ppm), giữa C-6‘
43
(117,97 ppm) với H-6‘ ( 6,65ppm) . Dựa vào phổ DEPT của EC ( hình 3.9) ta thấy có 6 tín hiệu 13C tại độ chuyển dịch C-2, C-3, C6, C-8, C-5‘, C-6‘. Ta khẳng định có 6 tín hiệu singlet của 6 nhóm CH.
44
Hình 3.8 b: Phổ 13C của EC trong dung môi DMSO
Trên phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC ( phụ lục 2) của EC ta thấy có sự tương tác gần giữa C-4 ( 28,19 ppm) với Hα ( 2,49 ppm) và Hβ (2,68 ppm). Kết hợp với phổ DEPT của EC ta thấy tín hiệu 13C tại độ dịch chuyển C-4 cho ta nhóm CH2.
Từ phổ DEPT của EC ta thấy tín hiệu của cacbon bậc 4: C-5 (156,52 ppm), C-7 ( 156,24 ppm), C-9 ( 155,57 ppm), C-10 ( 98,53 ppm), C-1‘ ( 130,63 ppm), C-4‘ ( 144,51 ppm). Các tín hiệu cácbon bậc 3 là : C-2 ( 78,07 ppm), C-3 ( 64,95 ppm), C-6 (
45
95,13 ppm), C-8 ( 94,13 ppm), C-3‘ ( 144,44 ppm), C-5‘ ( 114,78 ppm), C-6‘ ( 117,97 ppm).
Kết hợp với phổ HSQC và HMBC của FT2 ( phụ lục 2) cho ta gán chính xác các tương tác gần và xa của proton tương ứng liên kết trực tiếp với cacbon tương ứng. Thể hiện trên bảng 3.4.
Bảng 3.4 Phổ cộng hưởng từ của hợp chất EC ( dung môi DMSO-d6)
Stt δH(ppm) δC(ppm) 2 4.74 brs 78,07 d 3 4.01 mbr 64,95 d 4 Ha 2.49 m Hb 2.68dd 28,19 t 5 --- 156,52 s 6 5.89d J=2.5Hz 95,13 d 7 156,24 s 8 5.72d J=2.5Hz 94,13 d 9 --- 155,77 s 10 --- 98,53 s 1’ --- 130,63 s 2’ 6.89 J=1Hz 114,9 d 3’ --- 144,44 s 4’ --- 144,51 s 5’ 6.66 mbr 114,78 d 6’ 6.65t J=3Hz 117,97 d
46
Hình 3.9 Phổ DEPT của EC được ghi trong dung môi DMSO
47
Hình 3.10 Công thức cấu tạo của EC
3.4 Sản phẩm Epigallo catechin (EGC- kí hiệu TM2K).
3.4.1 Tinh chế EGC thô
Sản phẩm TM2K (EGC) với m= 3.54 g sau khi tách sắc kí được đem đi cô kiệt loại bỏ hết dung môi. Sau đó EGC được đem đi kết tinh lại trong dung dịch axít citric 0,5 % ở nồng độ quá bão hòa ~ 1,5 g/ml. Thời gian để kết tinh lại là qua đêm.
Dung dịch sau khi kết tinh lại ta đem cô cạn dung môi, chấm dịch sau khi cô cạn và so sánh với vệt EGC sạch và thấy rằng vẫn còn tạp chất trong dịch TM2K. Chúng tôi tiếp tục kết tinh lần thứ hai với quy trình như ở trên và thu được dịch TM2K. Chúng tôi chấm bản mỏng dịch TM2K kết tinh lần thứ hai này so sánh với vệt EGC sạch thì thấy dịch TM2K ( EGC) đã sạch tạp chất.
Đem cô kiệt dịch TM2K ( EGC) đã sạch tạp chất này ta thu được tinh thể, đem cân được khối lượng m = 3.12 g.
Mẫu TM2K (EGC) sạch này sau đó được đem đi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân-NMRS tại viện Khoa học và công nghệ Việt Nam để xác định cấu trúc của TM2K.
48
Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân của TM2K (EGC) ta có các phổ 1H và 13C NMR thể hiện như hình 3.11 a và hình 3.11 b:
Trên phổ1H và 13C -NMR kết hợp với phổ HSQC ( phụ lục 3) của TM2K ta thấy có sự tương tác gần giữa C-2‘ & 6‘ ( 106,36 ppm) với H-2 & 6‘ (6,38 ppm), giữa C-3‘ $ 5‘ ( 145,61 ppm) với H-3‘ & 5‘ (8,69 ppm), giữa C-4‘ (132,39 ppm) với H-4‘ (7,29 ppm), giữa C-2 ( 78,07 ppm) với H-2 ( 4,66 ppm), giữa C-3 ( 65,27 ppm) với H-3 ( 3,99 ppm), giữa C-6 ( 95,41 ppm) với H-6 ( 5,88 ppm), giữa C-7 (156,77 ppm) với H-7 (8,92 ppm), giữa C-8 (94,44 ppm) với H-8 ( 5,72 ppm). Dựa vào phổ DEPT của EGC ( hình 3.12) ta thấy có 10 tín hiệu 13C tại độ chuyển dịch C-2, C-3, C-6, C-7, C-8, C-4‘, C-2‘, C 6‘. Ta khẳng định có 8 tín hiệu singlet của 10 nhóm CH. Trên phổ1H và 13C -NMR kết hợp với phổ HSQC ( phụ lục 3) của TM2K ta thấy có sự tương tác gần giữa C-4 ( 28.04 ppm) với Hα ( 2,47 ppm) và Hβ (2,67 ppm). Kết hợp với phổ DEPT của TM2K ta thấy tín hiệu 13C tại độ dịch chuyển C-4 cho ta nhóm CH2.
49
Hình 3.11 a. Phổ 1H của EGCG được ghi trong dung môi DMSO-d6
Từ thông tin của phổ 1H-NMR, 13C-NMR chúng tôi dự kiến chất TM2K có chứa vòng benzen vì độ dịch chuyển δ của vòng benzen của phổ13C-NMR là 100- 140ppm, của phổ1H-NMR là 7-8ppm và do đó ta thấy rằng trên phổ 13C-NMR xuất hiện 12 tín hiệu cacbon vòng thơm. Các giá trị độ dịch chuyển ứng với vòng benzen bao gồm: 5 C bậc 4 ở các vị trí C-3‘ & 5‘ ( 145,61 ppm), C-4‘ (132,39 ppm), C-5 ( 156,44 ppm), C-7 ( 156,77 ppm) chứng tỏ 5 cacbon này liên kết với nhóm có hiệu ứng hút e ( 5 nhóm –OH ), 1 C bậc 4 là C-9 ( δ = 155,99 ppm) tương ứng với C liên
50
kết với -O, 2 C bậc 4 là C-10, C- 1‘ và 5 nhóm còn CH còn lại của vòng benen bậc ba là C-6, C-8, C-2‘, C-6‘ và C-1‘. Có 3 nhóm nằm ngoài vòng benzen lần lượt là C- 2 (78,38ppm), C-3 (65,27 ppm ) và C-4 ( 28,04 ppm).
Hình 3.11 b: : Phổ C13 được ghi trong dung môi DMSO-d6
Kết hợp với phổ HSQC và HMBC của TM2K ( phụ lục 3) cho ta gán chính xác các tương tác gần và xa của proton tương ứng liên kết trực tiếp với cacbon tương ứng. Thể hiện trên bảng 3.5.
51 Bảng 3.5 Phổ cộng hưởng từ của hợp chất TM2K (EGC) Stt δH(ppm) δC(ppm) 2 4.66 brs 78,38 d 3 3.99d J=2 64,27 d 4 Ha 2.47dd J=7 Hz Hb 2.67dd J= 7Hz 28,04 t 5 9.11brs(Ar-OH, C-5) 156,44 s 6 5.88d J=2 Hz 95,41 d 7 8.92 brs 156,77 d 8 5.72d J=2.5Hz 94,44 d 9 --- 155,6 s 10 --- 98,95 s 1’ --- 130,06 s 2’ & 6’ 6.38 brs (2H) 106,36 d ( 2C) 3’ & 5’ 8.69 brs ( Ar-OH, C3’& C5’) 145,61 s (2C )
4’ 7.92 brs ( Ar-OH, C 4’) 132,39 s
Phổ DEPT của EGC ta thấy tín hiệu của cacbon bậc 4: C-5 ( 156,44 ppm), C- 7 ( 156.77 ppm), C-9 (155.99 ppm), C-10 (98.95 ppm), C-1‘ ( 130.06 ppm) , C-3‘ & C-5‘ ( 145.61ppm), C-4‘ ( 132.39 ppm). Các tín hiệu cacbon bậc 3 là : C-2 (78.38ppm), C-3 ( 65.27ppm), C-6 ( 94.41ppm), C-8 ( 94.44ppm ), C-2‘ & C-6‘ ( 106.36ppm).
52
Hình 3.12 Phổ DEPT của EGC được ghi trong dung môi DMSO-d6
Từđó ta có thể dự kiến bộ khung của EGCG. Cấu trúc của EGC thể hiện trên hình 3.13
53
Hình 3.13 Công thức cấu tạo của EGC
3.5 Sản phẩm Epigalocatchin galat (EGCG –kí hiệu TM3K).
Từ 24,6g polyphenol, thông qua sắc khí cột chúng tôi đã thu được 9,82 g EGCG sạch. Sơđồ tách EGCG được trình bày như (hình 3.14).
EGCG sạch thu được sau khi chạy sắc kí được đem đi kết tinh lại để làm sạch nữa tạp chất ( TM3K). Mẫu TM3K sau đó được đem đi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR tại viện Khoa học và công nghệ Việt Nam để xác định cấu trúc. Ta thu được phổ 1H và 13C thể hiện trên hình 3.15 a và 3.15 b.
54 Hình 3.14 Quy trình tách EGCG Phổ 1H-NMR (500 MHZ, DMSO): δ (ppm): 4,95 ( 1H, brs, H-2 ); 5,3 ( 1H, brs, H-3 ); 2,66 (1H, d, J=17,5 Hz, H-4a); 2,93 (1H, dd, J=5; 17,5 Hz; H-4b); 9,27 (1H, brs, H-5); 5,93 (1H, d, J=2,2 Hz, H-6); 9,03 (1H, brs, H-7); 5,83 (1H, d, J=2,2 Hz, H-8); 6,41 (2H, brs, H-2’& 6’); 8,68 (2H, brs, H-3’& 5’); 7,98 (1H, brs, H-4’); 6,41 (2H, brs, H-2” & 6”); 9,16( 2H, brs, H-3”& 5”); 8,86 ( 1H, brs, H-4”).
55
56
Hình 3.15 b : Phổ C13 được ghi trong dung môi DMSO-d6
Phổ 13C-NMR (500 MHZ, DMSO): δ (ppm): 76,54 (d, C-2); 68,06 (d, C-3); 25,78 (t, C-4); 156,52 (s, C-5); 95,59 (d, C-6); 156,57 (s, C-7); 94,39 (d, C-8); 155,66 (s, C-9); 97,45 (s, C-10); 105,56 (d, C-2’&6’); 145,67 (d, C-3’&5’); 132,41 (s, C-4’); 165,26 (s, COO); 119,37 (s, C-1”); 108,74 (d, C-2” & 6”); 145,43 (s, C-3” & 5”); 138,59 (s, C-4”).
Kết hợp với phổ HSQC và HMBC của TM3K - EGCG ( phụ lục 4) cho ta gán chính xác các tương tác gần và xa của proton tương ứng liên kết trực tiếp với cacbon tương ứng. Thể hiện trên bảng 3.6.
57
Bảng 3.6 Phổ cộng hưởng từ của hợp chất EGCG (epi-Gallocatechin gallate)
Stt δH (ppm) δC (ppm) 2 4,95 brs 76,54 d 3 5,37 brs 68,06 d Ha: 2,66 d J = 17,5 Hz 4 Hb: 2,93 dd J = 5 Hz; 17,5 Hz 25,78 t 5 9,27 brs (Ar-OH, C5) 156,52 s 6 5,93 d J = 2 Hz 95,59 d 7 9,03 brs (Ar-OH, C7) 156,57 s 8 5,83 d J = 2,5 Hz 94,39 d 9 - - - 155,66 s 10 - - - 97,45 s 1’ - - - 128,69 s 2’ & 6’ 6,41 brs (2 H) 105,56 d (2 C) 3’ & 5’ 8,68 brs (2 Ar-OH, C3’ & C5’) 145,67 s (2 C)
4’ 7,98 brs (Ar-OH, C4’) 132,41 s
-COO- - - - 165,26 s
1’’ - - - 119,37 s
2’’ & 6’’ 6,81 brs (2 H) 108,74 d (2 C) 3’’ & 5’’ 9,16 brs (2 Ar-OH, C3’’ & C5’’) 145,43 s (2 C)
4’’ 8,86 brs (Ar-OH, C4’’) 138,59 s
Dung môi DMSO-d6
Nhìn phổ DEPT ( hình 3.16 ) của hợp chất phân tích ta thấy tín hiệu của cacbon bậc 4 C-1’ (128, 69 ppm); C-9 (94,39 ppm); C-10 (97,45 ppm); C-1’’ (119,37 ppm); và tín hiệu của cacbon bậc 3 tại C-2’’ & C-6 ’’ (105,56 ppm); C-8 (94,39 ppm); C-6 (95,59 ppm); C-2’’ & 6’’ (108,74 ppm).
58
Hình 3.16 Phổ DEPT của EGCG được ghi trong dung môi DMSO
Từđó ta có thể dự kiến bộ khung của Epigallocatechin gallate (EGCG) (hình 3.17 ). Cấu trúc của Epigallocatechin gallate (EGCG) được khẳng định thêm bởi các phân tích phổ 1H-NMR.
59
Hình 3.17 Công thức cấu tạo EGCG
Cụ thể ta thấy cấu trúc vòng A thông qua các proton H-8 và H-6 tương tác ortho với hằng số tương tác J = 2,2 HZ ( 5,38 và 5,93 ppm). Đồng thời ta thấy cấu trúc vòng C thể hiện ở các tín hiệu H-2 (4,95 ppm ); H-3 (5,37 ppm); và H4eq và H4 ax ( Ha (2,66 ppm ; J= 17,5HZ); (Hb (2,93 ppm ; J=5Hz; J=17,5HZ).
Cuối cùng so sánh các giá trị phổ khối 1H- NMR và 13C- NMR với tư liệu [41] Epigallocatechin gallate (EGCG) cho thấy sự trùng khớp. Như vậy với những kết quả phân tích như trên đã khẳng định cấu trúc của EGCG như hình 3.17.
60
KẾT LUẬN
Thực hiện đề tài "Nghiên cứu chiết tách các catechin có hoạt tính sinh học trong chè xanh Camllia sinensis L” chúng tôi đã thu được những kết quả sau:
1.Từ nguyên liệu chè xanh đã thu được tổng polyphenol có hàm lượng catechin cao và caffeine, tổng poyphenol là nguyên liệu để phân lập các catechin.
2. Bằng phương pháp sắc kí kết hợp, đã phân lập được 3 hợp chất từ cây huyết giác là :
9 Epicatechin – EC
9 Epigalo caechin – EGC
9 Epigalocatechin galat – EGCG
3. Cấu trúc của các hợp chất trên được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT ), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều ( HSQC, HMBC).
61
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đỗ Ngọc Quỹ, Nguyễn Kim Phong. Cây chè Việt Nam.NXB Nông Nghiệp. 1997. 2. GS. TS Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học 2003,
187-188.
3. Đỗ Ngọc Quý, Cây chè Việt Nam: Sản xuất, chế biến và tiêu thụ, NXB Nghệ An, 2003.
4. http://cnx.org/content/m30280/latest (24/07/2009)
5. N. Caffin et al. (2004), Developing an index of quality for Australian tea, © 2004 Rural Industries Research and Development Corp., Australia, 2004;
6. J. Tan et al. (2006), Brain Research, 2006, p. 216;
7. Nguyễn Văn Chung. Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm polyphenol từ chè xanh Việt Nam, TP Hồ Chí Minh tháng 12-2005.
8. Nguyễn Thị Kim Oanh, Nghiên cứu trích ly polyphenol từ lá trà để ứng dụng vào thực phẩm và dược phẩm, Luận văn thạc sĩ, Đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh, 2004.
9. Ngô Hữu Hợp, Hoá học và Hoá sinh chế biến là chè. NXB Nông nghiệp, 1972. 10. http://www.herbs-tech.com/product/egcg.asp
11. Saijo Ryoyasu (1982), Isolation and chemical structures of two new catechins from fresh tea leaf, Agric.Biol.Chem., 46(7), 1969-1970.
12. Nguyễn Thị Mai Phương, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Tác dụng của dịch chiết chè xanh lên vi khuẩn sâu răng , Tạp chí dược liệu, tập 8, số 4/2003 ( trang 110 – 114).
13. C.A. Rice-Evans et al. (1995), Free Radical Research, 22 (4), p. 375; 14. Chang.C.J, Chiu.K.L et.al. (2000), Food chemistry. 2000, 68, p. 109;
62
15. N. Salah et al. (1995), Archiv. Biochem. and Biophys.322 (2), p. 339; 16. F. Nanjo et al.(1996), Free Radical Biology and Medicine21 (6), p. 895; 17. S.Valcic et al. (1999), Chem. Res. in Toxicology,12 (4), p. 382;
18. H.H. Chow et al. (2003), Clinical Cancer Research, 9(9), p. 3312;
19. M.J. Lee et al. (2002), Cancer Epidemiology, Biomarkers, and Prevention, 11
(10/1), p. 1025;
20. K.M. Pisters et al. (2001), Journal of Clinical Oncology, 19 (6), p. 1830; 21. C.W. Chang et al. (1994), J. of Biomed. Sci., 1994;
22. C. Santos-Buelga et al. (2003), Methods in Polyphenol Analysis, ed. by C. Santos-Buelga and G. Williamson, Pub. by Hadcorver, England, 2003;
23. S.R. Prous et al. (2009), Process for the production of Botanical extracts, US Patent 2009/0042975;
24. I.A. Gilmour et al. (1997), Process for extraction of proanthocyanidins from Botanical material, WO Patent 97/44407;
25. H.N. Graham et al. (1992), Preventive Medicine, 21 (3), p. 334;
26. P.A. Dewdney, M.L. Meara. Natural fat-soluble antioxidants. Scientific and technical Surveys No96. The British Food Manufacturing Industries Research Association,1977;
27. Kj Duve et al. (1991), J. Am. Oil Chem. Soc., 1991, 68, p. 365;
28. M. Watanable, Y. ohshita, et.al. (1997), J Agric Food Chem. 1997, 45, p. 1039; 29. T. Constantina et al. (2003), Extraction Optimization in food Engineeering, New
York - Basel., 2003;
30. M. Sims (1990), Decaffeinating with cacbondioxide, Tea and Coffee Trade Journal, September Issue, 1990, p.8;
63 129;
32. Z. Djarmati et.al. (1991), J. Am. Oil Chem. Soc., 1991, 68, p. 731; 33. G. Nonaka et al. (1989), Poor and Appl. Chem., 61 (3), p. 357;
34. D.T. Bailey et al. (2001), Method for the isolation of caffein -free catechin from green tea, WO patent 01/5686;
35. D.C. Burdick et al. (2001), Procedure for the production of epigallocatechin gallate, EP patent 1077211;
36. M. Ibern-Gomez et al. (2002), Am. I. of Eno. & Vit., 53 (3), p. 218; 37. J.L. Rubichaud et al. (1990), J. of the Sci. F. Agri., 53, p. 343; 38. R. Rodriguez et al. (2005), J. of Chrom. A, 1066 (1-2), p. 105. 39. US patent 7012149
40. C.W. Chang, F.L. Hsu, J.Y. Lin (1994), “Inhibitory effects of polyphenolic catechins from Chinese green tea on HIV reverse transcriptase activity”, Journal of Biomedical Science (Basel, Swizerland).
64
PHỤ LỤC
A.Phụ lục 1
65
66
B. Phụ lục 2
68
Phụ lục 2.b : Phổ HMBC - 2D-NMR của FT2 (EC) trong dung môi DMSO-d6
69
70
71
C.Phụ lục 4
72