29
Polyphenol sau khi loại hết caffeine đã được sử dụng để tách các catechin, tiến trình tách thô trên cột Silicagel công nghiệp cỡ hạt (0,015 mm – 0,040 mm.) dùng bơm trung áp MPLC với hệ dung môi n-hexan/etylaxetat /etanol. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng trên hệ dung môi trên. Sau đó các vết trên bản mỏng được nhận biết bằng cách phun thuốc hiện màu Von’s Reagent rồi hơ nóng trên bếp điện cho đến khi bản mỏng hiện rõ vệt chất.
Cột chạy tách các catechin thô với đường kính 100mm và chiều dài 550 mm với lượng SLG là 1600g ( hình 2.3 ). Mẫu polyphenol được nạp lên cột m=24,6 g. Bơm chạy tốc độ 50 ml/phut.
Hình 2.3 Cột chạy tách các hợp chất catechin thô từ polyphenol
Cột được luyện bằng 3,5 lit n-hexan. Luyện cột xong, mẫu polyphenol được hòa trong etanol rồi dùng bơm trung áp MPLC đưa lên cột.
Tiến hành chạy gradien dung môi n-hexan/etylaxetat /etanol với độ phân cực tăng dần ((1:1:0,1), (1:2:0,1), (1:4:0,1), (1:9:0,9)), thu được 20 phân đoạn, sau đó dùng metanol 100% để rửa giải cột.
Quá trình chạy bỏđầu 2,8l, hứng các phân đoạn tiếp theo vào ống 500ml. Chấm các ống nghiệm so sánh các phân đoạn với EGCG, EGC, EC đã tách sạch từ trước để tìm phân đoạn có chứa EGCG, EGC, EC trên hệ triển khai n-hexan/etylaxetat /etanol
30
(1:4:0,1). Kí hiệu mỗi phân đoạn T1-T20. Kiểm tra phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng (TLC) T12-T16 cho các vệt giống nhau và có vệt tương đồng với vệt EGCG, EGC sạch. Gộp lại đem cô loại dung môi thu được EGCG và EGC thô. Kí hiệu TM (m=20,8g). Còn các ống T8 – T11 chấm bản mỏng cho các vệt giống nhau và tương đồng với vệt EC sạch, gộp lại đem cô loại bỏ dung môi thu được EC thô. Kí hiệu là FT2 ( m= 3.92 g).
Tiếp tục luyện cột bằng 4,5 lit n-hexan sau đó hòa mẫu TM ( chứa EGCG và EGC) trong etanol chạy trên cùng cột sắc kí với hệ dung môi n-hexan/etylaxetat /etanol ((1:2:0,1), (1:4:0,1), (4:1)). Bỏđầu 2,8 lít, tiếp đó hứng phân đoạn trên những ống 500ml thu được 15 phân đoạn. Chấm so sánh các phân đoạn với vệt EGCG, EGC sạch. Kiểm tra phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng (TLC cho thấy TM 8-TM12 cho các vệt giống nhau và giống với vệt EGCG và EGC sạch. Gộp lại đem cô kiệt dung môi. Kí hiệu mẫu TMK (m=17g). Các ống còn lại là tạp chất, loại bỏ.
Tiếp tục hòa mẫu TMK trong etanol chạy trên cột với đường kính 50 x 330 mm (hình 2.4 ) với hệ dung môi, n-hexan/etylaxetat /etanol ((1:2:0,1), (1:4:0,1), (4:1)). Nhồi SLG (0,040-0,063mm), tốc độ chạy của bơm 20ml/phút. Luyện cột bằng n- hexan, bỏđầu 400 ml, hứng phân đoạn trên ống 30ml, tổng ống hứng là 40 ống. Tiếp tục kiểm tra săc kí lớp mỏng thấy ống TMK 24 đến ống TMK34 đã loại hết tạp chất chỉ còn lại EGCG, chấm trên bản mỏng cho 1 vệt giống với vệt EGCG sạch. Gộp mẫu lại đem đi cô kiệt dung môi kí hiệu mẫu TM3K (m=9,82g). Kiểm tra sắc kí và thấy các ống TMK 16 đến ống TMK23 có vệt giống với vệt EGC sạch. Gộp các ống này lại và đem cô cạn dung môi ta được EGC thô ( m=3.54 g ).
Như vậy, từ nguyên liệu polyphenol thu được từ quá trình chiết ta đã phân lập được các catechin trong tổng polyphenol với thứ tự phân lập trong sắc kí là thu phân đoạn EC đầu tiên, sau đó là phân đoạn EGC và cuối cùng là thu phân đoạn EGCG
31
Hình 2.4 Cột tinh chế EGCG 2. 3 Các phương pháp phân tích sản phẩm
2.3.1 Sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ:
Các sản phẩm catechin phân lập từ chè xanh Việt Nam được phân tích định tính và bán định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối trực tuyến khối phổ (HPLC- MS) trên hệ thiết bị LC/MSD-Trap-SL Agilen 1100, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Điều kiện phân tích:
- Detector: ESI - MS và UV - Vis (210 - 254)
- Cột tách: 4,5 x 250 mm; Pha tĩnh RP C-18 cỡ hạt 5 µm;
- Pha động: Acetonitril/Metanol/Axit axetic: rửa giải theo cách gradient từ 99 : 0,98 : 0,02 (v/v) đến 70 : 29,4 : 0,6 (v/v);
- Detector UV-Vis: 254 nm, 290 nm, 590 nm; - Detector MSD-Trap-SL;
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút, 1,5 ml/phút và 2,5 ml/phút;
- Mẫu phân tích: 5 µl dung dịch mẫu pha trong CH3-OH nồng độ 5 mg/ml.
2.3.2 Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân:
Các sản phẩm catechin được phân lập từ chè xanh được khẳng định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C NMR trên máy NMR Bruker AVANCE 500 của Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Điều kiện đo: Chất nội chuẩn: TMS, dung môi: DMSO-d6.
32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tổng polyphenol thu nhận
Trong nội dung thí nghiệm chúng tôi đã thực hiện tách các polyphenol ra khỏi chè trước sau đó mới tách các chất diệp lục, caffeine và các chất màu ra sau.
Quá trình trên dùng chiết nguyên liệu với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1: 6 trong dung môi etanol 96 ◦C.
Với quy trình chiết trên chúng tôi đã thu được polyphenol sạch đạt 90%. Từ 200 g nguyên liệu ban đầu đã thu được 25,75 g polyphenol tổng số. Như vậy bước đầu quy trình đã tách được polyphenol tổng số ra khỏi chè đã thành công. Các mẫu pholyphenol này khi cô hết dung môi cho bột màu vàng thể hiện như (hình 3.1) :
Hình 3.1 Mẫu tinh thể polyphenol
33
Bảng 3.1 Đánh giá cảm quan về polyphenol
Tính chất Kết quả
Dạng Bột
Màu Vàng nhạt, ánh kim Độ tan Rất dễ tan trong etylaxetat Tính hút ẩm Hút ẩm mạnh, dễ chảy
Bước đầu đánh giá cảm quan chúng tôi nhận thấy rằng mẫu polyphenol của chúng tôi thu được là khá sạch và để khẳng định hơn nữa chúng tôi tiến hành gửi đi phân tích định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối khối phổ. Kết quả phân tích được thể hiện trên hình 3.2.a và 3.2.b:
34
Hình 3.2.b Các thông số phân tích mẫu tổng polyphenol
Dựa vào sắc kí phổ chúng tôi nhận dạng các hợp chính có trong polyphenol. Dưới đây là 1 bảng được tóm tắt từ phối phổ LC-MS các hợp chất so với tài liệu tham khảo [ 39].
Bảng 3.2 : Hàm lượng Catechin trong polyphenol đo LC-MS [39]
Stt Hợp chất US Patent 7012149 Mẫu chiết từ etanol
1 Axít gallic 0,01 % -
2 Catechin 2,30 % -
3 Caffeine 11,00 % ~ 1 %
4 Epigallocatechin gallat (EGCG) 38,10 % 43,66 %
5 Epicatechin (EC) 5,20 % 16,87 %
6 gallocatechin gallate 6,60 % 13,12 % 7 Epigallocatechin (EGC) 9,70 % 16,14%
35
Kết quả LC-MS cho thấy độ sạch của polyphenol thu được đạt tới hơn 90% với hàm lượng các catechin chủ yếu của chè xanh như sau: EGCG - 43,66%, EG - 16,86% , GCG - 13,12%, EGC - 16,24%. Như vậy có thể nhận thấy một điều là EGCG hợp chất mà ta quan tâm chiếm hàm lượng khá cao trong polyphenol, hơn thế nữa hàm lượng caffeine còn lại rất ít, lượng caffeine này còn rất ít khi chạy cột sẽ thu được. Từ đó có thể nhận thấy rằng quy trình chiết tách của sử dụng phương pháp chiết bằng etanol, trên thiết bị chiết Soxhlet đã thu được hiệu quả cao.
3.2 Caffeine (T4).
3.2.1 Tinh chế caffeine thô
Sơđồ tách Caffeine sạch được thể hiện trong ( hình 3.4).
Theo sơ đồ trên, từ caffeine thô , đã dùng phương pháp kết tinh lại qua nhiều giai đoạn đã thu được caffeine sạch. Từ 5,82g caffein thô tách từ nguyên liệu ban đầu đã thu được 3,8 g hợp chất T4 tinh thể hình kim đẹp.
Một vài hình ảnh về tinh thể caffeine được chúng tôi kết tinh được trình bày trong ( hình 3.3).
36
Hình 3.4 Sơđồ tinh chế Caffeine
Mới ban đầu cảm quan nhận định hợp chất T4 tách ra là caffeine đã được loại sạch các tạp chất. Song để khẳng định hơn kết luận này, tiến hành đo điểm chảy và dùng các phương pháp sắc kí. Bước đầu đo điểm chảy của hợp chất.
Tinh thể T4 được đo trên máy đo điểm chảy Buechi Melting Point B-540. Sử dụng ống Capila như một ông mao quản.
37
Lấy tinh thể ra ép khô bằng giấy lọc vài lần đến khô khi chắc chắn rằng tinh thểđã khô hoàn toàn. Cho một vài tinh thể vào ống capila đã hàn kín một đầu và cho vào máy.Đặt chế độ cho máy và quan sát trạng thái thay đổi của tinh thể T4
Khi nhiệt độ từ ban đầu đạt đến 230◦ C, quan sát thấy tinh thể co dần ở 2 bên thành capila. Nhiệt độ tăng lên từ từ. Đến 237◦ C, tinh thể bắt đầu chuyển sang dạng lỏng. Khi chảy nước có màu trắng trong, không bị hóa than. Như vậy, xác định được điểm chảy của tinh thể caffeine là 237◦ C.
So sánh với kết quả được công bố trong Merk Index thì T4 khả năng lớn là caffeine sạch.
Để xác định cấu trúc hóa học của T4, tiến hành gủi mẫu T4 đem đi đo phổ 1 chiều, phổ 2 chiều để khẳng định hợp chất.
3.2.2 Kết quả phân tích cấu trúc caffeine bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân – NMR:
Đem mẫu T4 thu được đi phân tích cộng hưởng từ hạt nhân ta có các phổ 1H và 13C NMR như hình 3.5 a và 3.5 b .
Dựa trên phổ 1H-NMR của hợp chất T4 ta thấy ban đầu có 3 tín hiệu singlet; H-10 (3,88 ppm); H-12 (3,19 ppm); H-14 (3,39 ppm) kết hợp HSQC của T4 ( phụ lục 1) ta thấy có 3 sự tương tác gần giữa C-10 (33,05 ppm) với H-10 (3,88 ppm); của C-12 (27,40 ppm)với H-12 (3,19 ppm) và C-14 (29,30 ppm) với H-14 (3,39 ppm). Kết hợp số liệu phổ DEPT 135 ( hình 3.6) tại các độ dịch chuyển C-10; C-12; C-14 ta khẳng định 3 tín hiệu singlet trên cho ta 3 nhóm CH3.
38
Hình 3.5a : Phổ 1H của caffein( T4) được ghi trong dung môi DMSO-d6
Trên phổ 1H-NMR ta thấy tín hiệu của hidro H-2 tại (7,97 ppm), kết hợp với HSQC ta thấy có sự tương tác gần giữa C-2 (142,73 ppm) với H-2 (7,97 ppm). Dựa vào phổ DEPT 90 ta thấy có tín hiệu CH tại độ chuyển dịch C-2 (142,73 ppm). Do vậy tín hiệu H-2 trên phổ 1H cho ta 1 proton nối đôi.
Ngoài ra dựa vào phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT 135 & 90 ( hình 3.6) của T4 cho tín hiệu của 3 nhóm CH3 tại C-10(33,05 ppm); C-12 (27,40 ppm); C-14 (29,30 ppm) và 3 cacbon nối đôi (sp2) C-2 (142,73 ppm); C-4 (106,56 ppm); C-9 (148,07 ppm). Nhìn tiếp trên phổ 13C-NMR ta còn thấy tín hiệu của C-5 tại (154,50 ppm)và của C-7 tại (151,01 ppm). Hơn nữa với phổ DEPT 135 và DEPT 90 không thấy xuất hiện pic nào tại 154,50 ppm và 151,01 ppm ta không thấy xuất hiện pick nào của CH3, CH2 và CH, hơn nữa độ chuyển dịch của cacbon này nằm trong khoảng từ 150-185 ppm nên đây là 2 cacbon (C=0) của nhóm amit.
39
Hình 3.5b : Phổ 13C của caffein( T4) được ghi trong dung môi DMSO-d6
Kết hợp dữ liệu trên ta thấy có thểđây là cấu trúc của caffeine. Điều này được khẳng định trên cơ sở so sánh với tư liệu [40].
Độ chuyển dịch hóa học của hợp chất T4.
Bảng 3.3: Độ chuyển dịch hóa học δH và δC của T4 ( caffeine).
Stt δH(ppm) δC(ppm)
2 7,97s (1H) 142,73 d
4 --- 106,56 s
40 7 --- 151,01 s 9 --- 148,07 s 10 3,86 brs (3H) 33,05 s 12 3,19 brs (3H) 27,40 s 14 3,39 brs (3H) 29,30 s Dung môi là DMSO-d6
Hình 3.6 Phổ DEPT của caffein ( T4) được ghi trong dung môi DMSO-d6
41
Hình 3.7 Công thức cấu tạo của caffein
Nhận xét:
Như vậy chúng tôi có thể khẳng định hợp chất T4 của cúng tôi là caffeine. Nhu vậy với việc lựa chọn dung môi và thao tác trên mẫu chè, chúng tôi đã thu được caffeine sạch 99%.
So với quy trình trên của chúng tôi, thu được caffeine thô chúng tôi dùng diclometan để tách hầu hết caffeine à các chlorophyl II ( chất diệp lục), cũng như các chất màu khác ra khỏi hỗn hợp dịch tổng ban đầu. So với một vài phương pháp chiết caffeine khỏi dịch chè như dùng nước nóng chiết, dùng etylaxetat, chloroform và đặc biệt dùng CO2 siêu tới hạn đã được báo cáo từ lâu thì chúng tôi thấy rằng so với chiết nước nóng và dung etyl axetat thì diclometan có lợi thế hơn rất nhiều, do diclometan có chứa gốc clo mà polyphenol lại không tan trong gốc clo, đó là ưu điểm lớn nhất chúng tôi chọn diclometan làm dung môi chiết xuất, hơn thế nữa so với chloroform thì diclometan lại ít độc hơn, mà dược phẩm cho dùng để chiết xuất các hợp chất hữu cơ. Hơn thế nữa với 1 cách dùng diclometan so với 1 kinh phí bỏ ra để tạo CO2 siêu tới hạn thì về lợi ích kinh tế cũng như trang thiết bị vật tư CO2 siêu tới hạn quá đắt so với lượng caffeine chúng tôi thu được, do vậy không được đánh giá cao. Từ đó chúng tôi lựa chọn diclometan để chiết xuất caffeine ra khỏi dịch chè, chúng tôi đã lựa chọn đúng và thành công được bước đầu khi chiết xuất ra caffeine thô.
42
Caffeine tan tốt trong clorofom, diclometan, và etyl axetat, song ở đây chúng tôi chọn etylaxetat làm dung môi để kết tinh caffeine. Trong dịch caffeine thô thì ngoài trừ caffeine ra dịch diclometan còn một số các chất màu, chất sáp, hay các diệp lục, nếu dùng chloroform, hay diclometan hòa tan quá tốt sẽ dẫn đến việc kết tinh ồ ạt như vậy sẽ không được sạch và ko thu được sản phẩm. Do vậy chúng tôi chọn etylaxetat để kết tinh lại caffeine.
3.3 Sản phẩm Epicatechin (EC- kí hiệu FT2)
3.3.1 Tinh chế EC thô
Sản phẩm FT2 thô (m= 3.92 g) sau khi tách sắc kí được đem đi cô kiệt loại bỏ hết dung môi etylaxetat. Sau đó EC được đem đi kết tinh lại trong dung dịch axít citric 0,5 % ở nồng độ quá bão hòa ~ 1,5 g/ml. Thời gian để kết tinh lại là qua đêm.
Dung dịch sau khi kết tinh lại ta đem cô cạn dung môi, chấm dịch sau khi cô cạn và so sánh với vệt EC sạch và thấy rằng vẫn còn tạp chất trong dịch FT2. Chúng tôi tiếp tục kết tinh lần thứ hai với quy trình nhưở trên. Lần này chúng tôi chấm và so sánh với vệt EC sạch thì thấy dịch FT2 ( EC) đã sạch tạp chất.
Đem cô kiệt dịch FT2 (EC) đã sạch tạp chất này ta thu được tinh thể, đem cân được khối lượng m = 3.52 g.
Mẫu FT2 (EC) sạch này sau đó được đem đi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMRS tại viện Khoa học và công nghệ Việt Nam để xác định cấu trúc cấu tạo của EC.
3.3.2 Kết quả phân tích cấu trúc FT2 ( EC) bằng NMR
Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân của FT2 (EC) ta có các phổ 1H và 13C NMR như hình 3.8 a và 3.8 b.
Trên phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC ( phụ lục 2) của EC ta thấy có sự tương tác gần giữa C-2 ( 78,07 ppm) với H-2 (4,74 ppm), giữa C-3 ( 64,95 ppm) với H-3 ( 4,01 ppm), giữa C-6 ( 95,13 ppm) với H-6 ( 5,89 ppm), giữa C-8 (94,13 ppm) với H-8 ( 5,89 ppm), giữa C-5‘ (114,78 ppm) với H-5‘ ( 6,66 ppm), giữa C-6‘
43
(117,97 ppm) với H-6‘ ( 6,65ppm) . Dựa vào phổ DEPT của EC ( hình 3.9) ta thấy có 6 tín hiệu 13C tại độ chuyển dịch C-2, C-3, C6, C-8, C-5‘, C-6‘. Ta khẳng định có 6 tín hiệu singlet của 6 nhóm CH.
44
Hình 3.8 b: Phổ 13C của EC trong dung môi DMSO
Trên phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC ( phụ lục 2) của EC ta thấy có sự tương tác gần giữa C-4 ( 28,19 ppm) với Hα ( 2,49 ppm) và Hβ (2,68 ppm). Kết hợp với phổ DEPT của EC ta thấy tín hiệu 13C tại độ dịch chuyển C-4 cho ta nhóm CH2.
Từ phổ DEPT của EC ta thấy tín hiệu của cacbon bậc 4: C-5 (156,52 ppm), C-7 ( 156,24 ppm), C-9 ( 155,57 ppm), C-10 ( 98,53 ppm), C-1‘ ( 130,63 ppm), C-4‘ ( 144,51 ppm). Các tín hiệu cácbon bậc 3 là : C-2 ( 78,07 ppm), C-3 ( 64,95 ppm), C-6 (
45
95,13 ppm), C-8 ( 94,13 ppm), C-3‘ ( 144,44 ppm), C-5‘ ( 114,78 ppm), C-6‘ ( 117,97 ppm).
Kết hợp với phổ HSQC và HMBC của FT2 ( phụ lục 2) cho ta gán chính xác các tương tác gần và xa của proton tương ứng liên kết trực tiếp với cacbon tương ứng.