Sơđồ tách Caffeine sạch được thể hiện trong ( hình 3.4).
Theo sơ đồ trên, từ caffeine thô , đã dùng phương pháp kết tinh lại qua nhiều giai đoạn đã thu được caffeine sạch. Từ 5,82g caffein thô tách từ nguyên liệu ban đầu đã thu được 3,8 g hợp chất T4 tinh thể hình kim đẹp.
Một vài hình ảnh về tinh thể caffeine được chúng tôi kết tinh được trình bày trong ( hình 3.3).
36
Hình 3.4 Sơđồ tinh chế Caffeine
Mới ban đầu cảm quan nhận định hợp chất T4 tách ra là caffeine đã được loại sạch các tạp chất. Song để khẳng định hơn kết luận này, tiến hành đo điểm chảy và dùng các phương pháp sắc kí. Bước đầu đo điểm chảy của hợp chất.
Tinh thể T4 được đo trên máy đo điểm chảy Buechi Melting Point B-540. Sử dụng ống Capila như một ông mao quản.
37
Lấy tinh thể ra ép khô bằng giấy lọc vài lần đến khô khi chắc chắn rằng tinh thểđã khô hoàn toàn. Cho một vài tinh thể vào ống capila đã hàn kín một đầu và cho vào máy.Đặt chế độ cho máy và quan sát trạng thái thay đổi của tinh thể T4
Khi nhiệt độ từ ban đầu đạt đến 230◦ C, quan sát thấy tinh thể co dần ở 2 bên thành capila. Nhiệt độ tăng lên từ từ. Đến 237◦ C, tinh thể bắt đầu chuyển sang dạng lỏng. Khi chảy nước có màu trắng trong, không bị hóa than. Như vậy, xác định được điểm chảy của tinh thể caffeine là 237◦ C.
So sánh với kết quả được công bố trong Merk Index thì T4 khả năng lớn là caffeine sạch.
Để xác định cấu trúc hóa học của T4, tiến hành gủi mẫu T4 đem đi đo phổ 1 chiều, phổ 2 chiều để khẳng định hợp chất.
3.2.2 Kết quả phân tích cấu trúc caffeine bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân – NMR:
Đem mẫu T4 thu được đi phân tích cộng hưởng từ hạt nhân ta có các phổ 1H và 13C NMR như hình 3.5 a và 3.5 b .
Dựa trên phổ 1H-NMR của hợp chất T4 ta thấy ban đầu có 3 tín hiệu singlet; H-10 (3,88 ppm); H-12 (3,19 ppm); H-14 (3,39 ppm) kết hợp HSQC của T4 ( phụ lục 1) ta thấy có 3 sự tương tác gần giữa C-10 (33,05 ppm) với H-10 (3,88 ppm); của C-12 (27,40 ppm)với H-12 (3,19 ppm) và C-14 (29,30 ppm) với H-14 (3,39 ppm). Kết hợp số liệu phổ DEPT 135 ( hình 3.6) tại các độ dịch chuyển C-10; C-12; C-14 ta khẳng định 3 tín hiệu singlet trên cho ta 3 nhóm CH3.
38
Hình 3.5a : Phổ 1H của caffein( T4) được ghi trong dung môi DMSO-d6
Trên phổ 1H-NMR ta thấy tín hiệu của hidro H-2 tại (7,97 ppm), kết hợp với HSQC ta thấy có sự tương tác gần giữa C-2 (142,73 ppm) với H-2 (7,97 ppm). Dựa vào phổ DEPT 90 ta thấy có tín hiệu CH tại độ chuyển dịch C-2 (142,73 ppm). Do vậy tín hiệu H-2 trên phổ 1H cho ta 1 proton nối đôi.
Ngoài ra dựa vào phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT 135 & 90 ( hình 3.6) của T4 cho tín hiệu của 3 nhóm CH3 tại C-10(33,05 ppm); C-12 (27,40 ppm); C-14 (29,30 ppm) và 3 cacbon nối đôi (sp2) C-2 (142,73 ppm); C-4 (106,56 ppm); C-9 (148,07 ppm). Nhìn tiếp trên phổ 13C-NMR ta còn thấy tín hiệu của C-5 tại (154,50 ppm)và của C-7 tại (151,01 ppm). Hơn nữa với phổ DEPT 135 và DEPT 90 không thấy xuất hiện pic nào tại 154,50 ppm và 151,01 ppm ta không thấy xuất hiện pick nào của CH3, CH2 và CH, hơn nữa độ chuyển dịch của cacbon này nằm trong khoảng từ 150-185 ppm nên đây là 2 cacbon (C=0) của nhóm amit.
39
Hình 3.5b : Phổ 13C của caffein( T4) được ghi trong dung môi DMSO-d6
Kết hợp dữ liệu trên ta thấy có thểđây là cấu trúc của caffeine. Điều này được khẳng định trên cơ sở so sánh với tư liệu [40].
Độ chuyển dịch hóa học của hợp chất T4.
Bảng 3.3: Độ chuyển dịch hóa học δH và δC của T4 ( caffeine).
Stt δH(ppm) δC(ppm)
2 7,97s (1H) 142,73 d
4 --- 106,56 s
40 7 --- 151,01 s 9 --- 148,07 s 10 3,86 brs (3H) 33,05 s 12 3,19 brs (3H) 27,40 s 14 3,39 brs (3H) 29,30 s Dung môi là DMSO-d6
Hình 3.6 Phổ DEPT của caffein ( T4) được ghi trong dung môi DMSO-d6
41
Hình 3.7 Công thức cấu tạo của caffein
Nhận xét:
Như vậy chúng tôi có thể khẳng định hợp chất T4 của cúng tôi là caffeine. Nhu vậy với việc lựa chọn dung môi và thao tác trên mẫu chè, chúng tôi đã thu được caffeine sạch 99%.
So với quy trình trên của chúng tôi, thu được caffeine thô chúng tôi dùng diclometan để tách hầu hết caffeine à các chlorophyl II ( chất diệp lục), cũng như các chất màu khác ra khỏi hỗn hợp dịch tổng ban đầu. So với một vài phương pháp chiết caffeine khỏi dịch chè như dùng nước nóng chiết, dùng etylaxetat, chloroform và đặc biệt dùng CO2 siêu tới hạn đã được báo cáo từ lâu thì chúng tôi thấy rằng so với chiết nước nóng và dung etyl axetat thì diclometan có lợi thế hơn rất nhiều, do diclometan có chứa gốc clo mà polyphenol lại không tan trong gốc clo, đó là ưu điểm lớn nhất chúng tôi chọn diclometan làm dung môi chiết xuất, hơn thế nữa so với chloroform thì diclometan lại ít độc hơn, mà dược phẩm cho dùng để chiết xuất các hợp chất hữu cơ. Hơn thế nữa với 1 cách dùng diclometan so với 1 kinh phí bỏ ra để tạo CO2 siêu tới hạn thì về lợi ích kinh tế cũng như trang thiết bị vật tư CO2 siêu tới hạn quá đắt so với lượng caffeine chúng tôi thu được, do vậy không được đánh giá cao. Từ đó chúng tôi lựa chọn diclometan để chiết xuất caffeine ra khỏi dịch chè, chúng tôi đã lựa chọn đúng và thành công được bước đầu khi chiết xuất ra caffeine thô.
42
Caffeine tan tốt trong clorofom, diclometan, và etyl axetat, song ở đây chúng tôi chọn etylaxetat làm dung môi để kết tinh caffeine. Trong dịch caffeine thô thì ngoài trừ caffeine ra dịch diclometan còn một số các chất màu, chất sáp, hay các diệp lục, nếu dùng chloroform, hay diclometan hòa tan quá tốt sẽ dẫn đến việc kết tinh ồ ạt như vậy sẽ không được sạch và ko thu được sản phẩm. Do vậy chúng tôi chọn etylaxetat để kết tinh lại caffeine.
3.3 Sản phẩm Epicatechin (EC- kí hiệu FT2)
3.3.1 Tinh chế EC thô
Sản phẩm FT2 thô (m= 3.92 g) sau khi tách sắc kí được đem đi cô kiệt loại bỏ hết dung môi etylaxetat. Sau đó EC được đem đi kết tinh lại trong dung dịch axít citric 0,5 % ở nồng độ quá bão hòa ~ 1,5 g/ml. Thời gian để kết tinh lại là qua đêm.
Dung dịch sau khi kết tinh lại ta đem cô cạn dung môi, chấm dịch sau khi cô cạn và so sánh với vệt EC sạch và thấy rằng vẫn còn tạp chất trong dịch FT2. Chúng tôi tiếp tục kết tinh lần thứ hai với quy trình nhưở trên. Lần này chúng tôi chấm và so sánh với vệt EC sạch thì thấy dịch FT2 ( EC) đã sạch tạp chất.
Đem cô kiệt dịch FT2 (EC) đã sạch tạp chất này ta thu được tinh thể, đem cân được khối lượng m = 3.52 g.
Mẫu FT2 (EC) sạch này sau đó được đem đi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMRS tại viện Khoa học và công nghệ Việt Nam để xác định cấu trúc cấu tạo của EC.
3.3.2 Kết quả phân tích cấu trúc FT2 ( EC) bằng NMR
Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân của FT2 (EC) ta có các phổ 1H và 13C NMR như hình 3.8 a và 3.8 b.
Trên phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC ( phụ lục 2) của EC ta thấy có sự tương tác gần giữa C-2 ( 78,07 ppm) với H-2 (4,74 ppm), giữa C-3 ( 64,95 ppm) với H-3 ( 4,01 ppm), giữa C-6 ( 95,13 ppm) với H-6 ( 5,89 ppm), giữa C-8 (94,13 ppm) với H-8 ( 5,89 ppm), giữa C-5‘ (114,78 ppm) với H-5‘ ( 6,66 ppm), giữa C-6‘
43
(117,97 ppm) với H-6‘ ( 6,65ppm) . Dựa vào phổ DEPT của EC ( hình 3.9) ta thấy có 6 tín hiệu 13C tại độ chuyển dịch C-2, C-3, C6, C-8, C-5‘, C-6‘. Ta khẳng định có 6 tín hiệu singlet của 6 nhóm CH.
44
Hình 3.8 b: Phổ 13C của EC trong dung môi DMSO
Trên phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC ( phụ lục 2) của EC ta thấy có sự tương tác gần giữa C-4 ( 28,19 ppm) với Hα ( 2,49 ppm) và Hβ (2,68 ppm). Kết hợp với phổ DEPT của EC ta thấy tín hiệu 13C tại độ dịch chuyển C-4 cho ta nhóm CH2.
Từ phổ DEPT của EC ta thấy tín hiệu của cacbon bậc 4: C-5 (156,52 ppm), C-7 ( 156,24 ppm), C-9 ( 155,57 ppm), C-10 ( 98,53 ppm), C-1‘ ( 130,63 ppm), C-4‘ ( 144,51 ppm). Các tín hiệu cácbon bậc 3 là : C-2 ( 78,07 ppm), C-3 ( 64,95 ppm), C-6 (
45
95,13 ppm), C-8 ( 94,13 ppm), C-3‘ ( 144,44 ppm), C-5‘ ( 114,78 ppm), C-6‘ ( 117,97 ppm).
Kết hợp với phổ HSQC và HMBC của FT2 ( phụ lục 2) cho ta gán chính xác các tương tác gần và xa của proton tương ứng liên kết trực tiếp với cacbon tương ứng. Thể hiện trên bảng 3.4.
Bảng 3.4 Phổ cộng hưởng từ của hợp chất EC ( dung môi DMSO-d6)
Stt δH(ppm) δC(ppm) 2 4.74 brs 78,07 d 3 4.01 mbr 64,95 d 4 Ha 2.49 m Hb 2.68dd 28,19 t 5 --- 156,52 s 6 5.89d J=2.5Hz 95,13 d 7 156,24 s 8 5.72d J=2.5Hz 94,13 d 9 --- 155,77 s 10 --- 98,53 s 1’ --- 130,63 s 2’ 6.89 J=1Hz 114,9 d 3’ --- 144,44 s 4’ --- 144,51 s 5’ 6.66 mbr 114,78 d 6’ 6.65t J=3Hz 117,97 d
46
Hình 3.9 Phổ DEPT của EC được ghi trong dung môi DMSO
47
Hình 3.10 Công thức cấu tạo của EC
3.4 Sản phẩm Epigallo catechin (EGC- kí hiệu TM2K).
3.4.1 Tinh chế EGC thô
Sản phẩm TM2K (EGC) với m= 3.54 g sau khi tách sắc kí được đem đi cô kiệt loại bỏ hết dung môi. Sau đó EGC được đem đi kết tinh lại trong dung dịch axít citric 0,5 % ở nồng độ quá bão hòa ~ 1,5 g/ml. Thời gian để kết tinh lại là qua đêm.
Dung dịch sau khi kết tinh lại ta đem cô cạn dung môi, chấm dịch sau khi cô cạn và so sánh với vệt EGC sạch và thấy rằng vẫn còn tạp chất trong dịch TM2K. Chúng tôi tiếp tục kết tinh lần thứ hai với quy trình như ở trên và thu được dịch TM2K. Chúng tôi chấm bản mỏng dịch TM2K kết tinh lần thứ hai này so sánh với vệt EGC sạch thì thấy dịch TM2K ( EGC) đã sạch tạp chất.
Đem cô kiệt dịch TM2K ( EGC) đã sạch tạp chất này ta thu được tinh thể, đem cân được khối lượng m = 3.12 g.
Mẫu TM2K (EGC) sạch này sau đó được đem đi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân-NMRS tại viện Khoa học và công nghệ Việt Nam để xác định cấu trúc của TM2K.
48
Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân của TM2K (EGC) ta có các phổ 1H và 13C NMR thể hiện như hình 3.11 a và hình 3.11 b:
Trên phổ1H và 13C -NMR kết hợp với phổ HSQC ( phụ lục 3) của TM2K ta thấy có sự tương tác gần giữa C-2‘ & 6‘ ( 106,36 ppm) với H-2 & 6‘ (6,38 ppm), giữa C-3‘ $ 5‘ ( 145,61 ppm) với H-3‘ & 5‘ (8,69 ppm), giữa C-4‘ (132,39 ppm) với H-4‘ (7,29 ppm), giữa C-2 ( 78,07 ppm) với H-2 ( 4,66 ppm), giữa C-3 ( 65,27 ppm) với H-3 ( 3,99 ppm), giữa C-6 ( 95,41 ppm) với H-6 ( 5,88 ppm), giữa C-7 (156,77 ppm) với H-7 (8,92 ppm), giữa C-8 (94,44 ppm) với H-8 ( 5,72 ppm). Dựa vào phổ DEPT của EGC ( hình 3.12) ta thấy có 10 tín hiệu 13C tại độ chuyển dịch C-2, C-3, C-6, C-7, C-8, C-4‘, C-2‘, C 6‘. Ta khẳng định có 8 tín hiệu singlet của 10 nhóm CH. Trên phổ1H và 13C -NMR kết hợp với phổ HSQC ( phụ lục 3) của TM2K ta thấy có sự tương tác gần giữa C-4 ( 28.04 ppm) với Hα ( 2,47 ppm) và Hβ (2,67 ppm). Kết hợp với phổ DEPT của TM2K ta thấy tín hiệu 13C tại độ dịch chuyển C-4 cho ta nhóm CH2.
49
Hình 3.11 a. Phổ 1H của EGCG được ghi trong dung môi DMSO-d6
Từ thông tin của phổ 1H-NMR, 13C-NMR chúng tôi dự kiến chất TM2K có chứa vòng benzen vì độ dịch chuyển δ của vòng benzen của phổ13C-NMR là 100- 140ppm, của phổ1H-NMR là 7-8ppm và do đó ta thấy rằng trên phổ 13C-NMR xuất hiện 12 tín hiệu cacbon vòng thơm. Các giá trị độ dịch chuyển ứng với vòng benzen bao gồm: 5 C bậc 4 ở các vị trí C-3‘ & 5‘ ( 145,61 ppm), C-4‘ (132,39 ppm), C-5 ( 156,44 ppm), C-7 ( 156,77 ppm) chứng tỏ 5 cacbon này liên kết với nhóm có hiệu ứng hút e ( 5 nhóm –OH ), 1 C bậc 4 là C-9 ( δ = 155,99 ppm) tương ứng với C liên
50
kết với -O, 2 C bậc 4 là C-10, C- 1‘ và 5 nhóm còn CH còn lại của vòng benen bậc ba là C-6, C-8, C-2‘, C-6‘ và C-1‘. Có 3 nhóm nằm ngoài vòng benzen lần lượt là C- 2 (78,38ppm), C-3 (65,27 ppm ) và C-4 ( 28,04 ppm).
Hình 3.11 b: : Phổ C13 được ghi trong dung môi DMSO-d6
Kết hợp với phổ HSQC và HMBC của TM2K ( phụ lục 3) cho ta gán chính xác các tương tác gần và xa của proton tương ứng liên kết trực tiếp với cacbon tương ứng. Thể hiện trên bảng 3.5.
51 Bảng 3.5 Phổ cộng hưởng từ của hợp chất TM2K (EGC) Stt δH(ppm) δC(ppm) 2 4.66 brs 78,38 d 3 3.99d J=2 64,27 d 4 Ha 2.47dd J=7 Hz Hb 2.67dd J= 7Hz 28,04 t 5 9.11brs(Ar-OH, C-5) 156,44 s 6 5.88d J=2 Hz 95,41 d 7 8.92 brs 156,77 d 8 5.72d J=2.5Hz 94,44 d 9 --- 155,6 s 10 --- 98,95 s 1’ --- 130,06 s 2’ & 6’ 6.38 brs (2H) 106,36 d ( 2C) 3’ & 5’ 8.69 brs ( Ar-OH, C3’& C5’) 145,61 s (2C )
4’ 7.92 brs ( Ar-OH, C 4’) 132,39 s
Phổ DEPT của EGC ta thấy tín hiệu của cacbon bậc 4: C-5 ( 156,44 ppm), C- 7 ( 156.77 ppm), C-9 (155.99 ppm), C-10 (98.95 ppm), C-1‘ ( 130.06 ppm) , C-3‘ & C-5‘ ( 145.61ppm), C-4‘ ( 132.39 ppm). Các tín hiệu cacbon bậc 3 là : C-2 (78.38ppm), C-3 ( 65.27ppm), C-6 ( 94.41ppm), C-8 ( 94.44ppm ), C-2‘ & C-6‘ ( 106.36ppm).
52
Hình 3.12 Phổ DEPT của EGC được ghi trong dung môi DMSO-d6
Từđó ta có thể dự kiến bộ khung của EGCG. Cấu trúc của EGC thể hiện trên hình 3.13
53
Hình 3.13 Công thức cấu tạo của EGC
3.5 Sản phẩm Epigalocatchin galat (EGCG –kí hiệu TM3K).
Từ 24,6g polyphenol, thông qua sắc khí cột chúng tôi đã thu được 9,82 g EGCG sạch. Sơđồ tách EGCG được trình bày như (hình 3.14).
EGCG sạch thu được sau khi chạy sắc kí được đem đi kết tinh lại để làm sạch nữa tạp chất ( TM3K). Mẫu TM3K sau đó được đem đi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR tại viện Khoa học và công nghệ Việt Nam để xác định cấu trúc. Ta thu được phổ 1H và 13C thể hiện trên hình 3.15 a và 3.15 b.
54 Hình 3.14 Quy trình tách EGCG Phổ 1H-NMR (500 MHZ, DMSO): δ (ppm): 4,95 ( 1H, brs, H-2 ); 5,3 ( 1H, brs, H-3 ); 2,66 (1H, d, J=17,5 Hz, H-4a); 2,93 (1H, dd, J=5; 17,5 Hz; H-4b); 9,27 (1H, brs, H-5); 5,93 (1H, d, J=2,2 Hz, H-6); 9,03 (1H, brs, H-7); 5,83 (1H, d, J=2,2 Hz, H-8); 6,41 (2H, brs, H-2’& 6’); 8,68 (2H, brs, H-3’& 5’); 7,98 (1H, brs, H-4’); 6,41 (2H, brs, H-2” & 6”); 9,16( 2H, brs, H-3”& 5”); 8,86 ( 1H, brs, H-4”).
55
56
Hình 3.15 b : Phổ C13 được ghi trong dung môi DMSO-d6
Phổ 13C-NMR (500 MHZ, DMSO): δ (ppm): 76,54 (d, C-2); 68,06 (d, C-3); 25,78 (t, C-4); 156,52 (s, C-5); 95,59 (d, C-6); 156,57 (s, C-7); 94,39 (d, C-8); 155,66 (s, C-9); 97,45 (s, C-10); 105,56 (d, C-2’&6’); 145,67 (d, C-3’&5’); 132,41 (s, C-4’); 165,26 (s, COO); 119,37 (s, C-1”); 108,74 (d, C-2” & 6”); 145,43 (s, C-3” & 5”); 138,59 (s, C-4”).
Kết hợp với phổ HSQC và HMBC của TM3K - EGCG ( phụ lục 4) cho ta gán chính xác các tương tác gần và xa của proton tương ứng liên kết trực tiếp với cacbon tương ứng. Thể hiện trên bảng 3.6.
57
Bảng 3.6 Phổ cộng hưởng từ của hợp chất EGCG (epi-Gallocatechin gallate)
Stt δH (ppm) δC (ppm) 2 4,95 brs 76,54 d 3 5,37 brs 68,06 d Ha: 2,66 d J = 17,5 Hz 4 Hb: 2,93 dd J = 5 Hz; 17,5 Hz 25,78 t 5 9,27 brs (Ar-OH, C5) 156,52 s 6 5,93 d J = 2 Hz 95,59 d 7 9,03 brs (Ar-OH, C7) 156,57 s 8 5,83 d J = 2,5 Hz 94,39 d 9 - - - 155,66 s 10 - - - 97,45 s 1’ - - - 128,69 s 2’ & 6’ 6,41 brs (2 H) 105,56 d (2 C) 3’ & 5’ 8,68 brs (2 Ar-OH, C3’ & C5’) 145,67 s (2 C)
4’ 7,98 brs (Ar-OH, C4’) 132,41 s
-COO- - - - 165,26 s
1’’ - - - 119,37 s
2’’ & 6’’ 6,81 brs (2 H) 108,74 d (2 C) 3’’ & 5’’ 9,16 brs (2 Ar-OH, C3’’ & C5’’) 145,43 s (2 C)
4’’ 8,86 brs (Ar-OH, C4’’) 138,59 s
Dung môi DMSO-d6
Nhìn phổ DEPT ( hình 3.16 ) của hợp chất phân tích ta thấy tín hiệu của cacbon bậc 4 C-1’ (128, 69 ppm); C-9 (94,39 ppm); C-10 (97,45 ppm); C-1’’ (119,37 ppm); và tín hiệu của cacbon bậc 3 tại C-2’’ & C-6 ’’ (105,56 ppm); C-8 (94,39 ppm); C-6 (95,59 ppm); C-2’’ & 6’’ (108,74 ppm).
58
Hình 3.16 Phổ DEPT của EGCG được ghi trong dung môi DMSO
Từđó ta có thể dự kiến bộ khung của Epigallocatechin gallate (EGCG) (hình 3.17 ). Cấu trúc của Epigallocatechin gallate (EGCG) được khẳng định thêm bởi các phân tích phổ 1H-NMR.
59
Hình 3.17 Công thức cấu tạo EGCG
Cụ thể ta thấy cấu trúc vòng A thông qua các proton H-8 và H-6 tương tác