Để có thể định danh một cách chính xác các chủng vi khuẩn phân lập được ở mức độ loài thì gần như toàn bộ thông tin về trình tự DNA mã hóa cho phân tử rDNA 16S phải được biết thật đầy đủ, vì thế cần tiến hành phản ứng PCR để khuếch đại toàn bộ trình tự rDNA 16S từ khuôn là DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn phân lập được. Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi 16S rDNA.
Kết quả PCR 4 mẫu vi khuẩn được thể hiện ở hình sau:
Ladder M1.A M1.B M1.C M1.D
Hình 4.3 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 63F – 1489R.
Kết quả chạy PCR cho ra band, ở giếng thứ 2 ứng với mẫu M1.A có band sáng rõ. Còn giếng thứ 3 ứng với mẫu M1.B, giếng thứ 4 ứng với mẫu M1.C, giếng thứ 5 ứng với mẫu M1.D có band, nhưng band sáng không được rõ.
Phân tích trình tự rDNA 16S
Kết quả giải trình tự (phụ lục) sẽ được xử lý bằng phần mềm fast PCR để tạo ra các trình tự rDNA nguyên vẹn của mỗi chủng vi khuẩn. Trình tự rDNA 16S nguyên vẹn này sẽ được so sánh với các trình tự DNA của các chủng vi khuẩn khác trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm BLAST.
Sau khi giải trình tự các mẫu vi khuẩn phân lập được cho ra kết quả. Mẫu M1.A được xác định là chủng Bacillus licheniformis. Ba mẫu M1.B, M1.C, M1.D có kết quả tương đồng giữa các chủng Bacillus cereus, Bacillus thuringienses, Bacillus anthracis và chủng Bacillus salmalaya. Kết hợp với kết quả của phân tích các chỉ tiêu sinh hóa cho thấy chủng M1.B và M1.C có nhiều đặc điểm tương đồng với Bacillus cereus, còn chủng M1.D có kết quả tương đồng với chủng Bacillus anthracis.