Dương xỉ có hai nhánh chính : dương xỉ Microsorum và dương xỉ Bolbitis. Dương xỉ Microsorum được đại diện bởi dương xỉ java (dương xỉ lá thường) trong hàng ngàn họ dương xỉ khác nhau. Hầu hết chúng đều là thực vật biểu sinh – những thực vật mọc trên giá thể như đá thay vì mọc trong đất, dương xỉ thường mọc ở khu vực ẩm ướt. Dương xỉ java thông thường tìm thấy ở khu vực Đông Nam Á, chúng rất phổ biến ở đây. Dương xỉ Bolbitis có tên thông thường là dương xỉ châu Phi. Chúng thường được tìm thấy ở khu vực rừng nhiệt đới CongGo hay khu vực Tây Phi.
Pteris vittata (còn được gọi là dương xỉ diều hâu) là một cây dương xỉ thuộc giới
Plentae, nghành Pteridophyta, lớp Pteridosita, bộ Polypodiales, họ Pteridaccea, chi Pteris.
Pteris vittata thường phát triển trên môi trường có đá vôi, trên các vết nức bê tông. Mark
Elless thuộc tập đoàn hệ thống Edenspace ở Dulles, bang Virginia, mỹ và cộng sự đã phát hiện thấy loài dương xỉ Pteris vittata có khả năng hút Asen ra khỏi nước bẩn. Pteiris
vittata được xác định như là một cây siêu tích lũy Asen. Mỗi kg thực vật này có thể hấp
thụ 22g Asen, và chúng mọc rất nhanh. Trong nghiên cứu gần đây nhất, Elless và cộng sự đã kiểm tra khả năng thực tế của loài dương xỉ này bằng cách đo lượng Asen mà chúng hấp thụ được và thời gian để làm việc đó. Họ phát hiện thấy loài cây này làm giảm nồng độ Asen từ mức 200 mg/l nước xuống còn chưa đầy 1%, thấp hơn tiêu chuẩn nước sạch của Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ, chỉ trong vòng chưa đầy 1 ngày.
Các nhà nghiên cứu cho biết, loài dương xỉ này cứng và phát triển rất nhanh. Chúng có tiềm năng lớn trong việc khắc phục hiện tượng nhiễm Asen trên các vùng đất nông nghiệp. Dương xỉ diều hâu có thể hấp thụ Asen và các hợp chất của nó trong thời gian rất ngắn. Các cuộc kiểm tra cho thấy, hàm lượng Asen trong dương xỉ tăng lên 126 lần chỉ sau 2 tuần được chuyển sang vùng đất bị ô nhiễm.
Hình 2.2 Cây dương xỉ Pteris vittata. (nguồn: cayhoacanh.com). 2.11. Một số nghiên cứu về sử dụng cây dương xỉ để xử lí Asen
Mô hình xử lý đất nhiễm Asen ở mỏ thiếc Núi Pháo, Hà Thượng của Bùi Thị Kim Anh – Trường Đại học Khoa Tự Nhiên (năm 2011).
Mô hình nghiên cứu của Bùi Thị Kim Anh sử dụng hai loại cây dương xỉ là
P.Vittata và P.Calomelanos hấp thụ Asen trong đất.
Kết quả mô hình nghiên cứu của Bùi Thị Kim Anh cho thấy, đất sau khi cải tạo thì hàm lượng Asen đã giảm đi đáng kể được 1755,4 mg/kg (giảm 38,8 % so với ban đầu). Kết quả này là phù hợp, vì tác giả đã bổ sung một lượng lớn phân bón, vôi bột vào đất nên hàm lượng Asen bị ô nhiễm ở tầng đất từ 0 – 20 cm đã được pha loãng. Mặc khác, cây mồi sau hai đợt cải tạo đất không tách khỏi đất mà được trộn vào đất nên một lượng lớn lá và thân cây mục nát cũng làm pha loãng lượng Asen có trong đất.
Kết quả của mô hình nghiên cứu: trồng hai loại dương xỉ P.vitatata và P.calomelanos ở 700 m2 trong 1 năm có thể hút thu 15,28 kg Asen. Nếu trồng hai loại dương xỉ trên ở 1 ha (10000 m2) đất thì hàm lượng Asen có thể tách chiết ra khỏi đất
trong vòng 1 năm là 218,3 kg/ha. Đây là một lượng Asen đáng kể được tách ra khỏi đất. Tuy nhiên, trong thực tế đất được làm sạch không chỉ do mỗi khả năng tách chiết Asen ra khỏi đất bằng dương xỉ mà còn thông qua nhiều con đường khác nhau như khả năng bay hơi qua khí khổng, hiệu quả làm sạch của vi sinh vật trong đất tự nhiên, hiệu quả của các loại vi sinh vật sống cộng sinh trong rễ cây và khả năng rửa trôi tự nhiên.
Hai loài dương xỉ Pteris vittata và Pityrogramma calomelanos có khả năng chống chịu khá tốt trong đất có hàm lượng Asen linh động tương ứng lên tới 1500 mg/kg và 900 mg/kg. Chúng còn có thể sống được trong đất thải của quặng có chứa 15,146 ppm Asen tổng số.
Nghiên cứu ảnh hưởng của Nito, Photpho lên khả năng sinh trưởng và tích lũy Asen của loài dương xỉ Pteris vittata của nhóm nghiên cứu: Bùi Thị Kim Anh, Trần Văn Tựa, Đặng Đình Kim, Phạm Thị Huyền Trang.
Đối tượng nghiên cứu là loài dương xỉ Pteris vittata L. được lấy từ khu vực ô nhiễm kim loại nặng xung quanh các mỏ chì và kẽm tại Làng Hích, Thái Nguyên.
Kết quả của nghiên cứu này cho thấy hàm lượng Asen tích lũy ở phần trên mặt đất của Pteris vittata luôn cao hơn nhiều so với phần rẽ. Đây là một ưu điểm rất lớn của loài dương xỉ này khi ứng dụng vào xử lý môi trường.
Qua kết quả của những nghiên cứu này, cho thấy cây dương xỉ Pteris vittata là loài hấp thụ Asen nhanh và hiệu quả.
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ tháng 12/2014 đến tháng 06/2015
Địa điểm: Phòng Bệnh học người, Tòa nhà A1. Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường – Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Dụng cụ và vật liệu3.2.1.Đối tượng nghiên cứu3.2.1.Đối tượng nghiên cứu3.2.1.Đối tượng nghiên cứu 3.2.1.Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn có trong lá và thân cây dương xỉ
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Dùng cho phân lập vi khuẩn
- Tủ cấy vi sinh - Tủ ấm - Tủ lạnh - Tủ sấy - Lò mircowate - Máy lắc - Nồi hấp khử trùng - Dụng cụ đo pH - Đĩa petri - Ống nghiệm - Cân phân tích - Que cấy - Đèn cồn - Một số vật dụng có liên quan Dùng cho xác định vi khuẩn - Lam – lame - Kính hiển vi quang học
- Máy PCR (Master cycler Nexus, Eppendorf, Đức) - Máy điện di gel (Mupid – Exu, Nhật Bản)
- Ống eppendoft (25 – 50 µl)
- Máy ly tâm (Beckman Coulter, Đức)
- Các thiết bị khác có liên quan
Hình 3.1 Tủ cấy vi sinh.
3.2.3. Môi trường và hóa chất
3.2.3.1.Môi trường và hóa chất dùng cho phương pháp nuôi cấy
- Môi trường TYEG
- Dung dịch tăng sinh vi khuẩn
- Môi trường dùng trong các phản ứng sinh hóa
3.2.3.2. Môi trường và hóa chất dùng cho phản ứng PCR
- CH3COONa - TE Buffer - Ethanol
- PCR Master Mix
3.3. Phương pháp nghiên cứu
Nguồn mẫu
Thí nghiệm 1
Phân lập và tuyển chọn những vi khuẩn sống trong môi trường có arsenat
Chọn những vi khuẩn chống chịu nồng độ arsenat cao để định danh
Những chủng vi khuẩn đã qua sàn lọc
Kết luận
Hình 3.3 Các bước thí nghiệm. 3.3.1. Lấy mẫu
Mẫu lá cây dương xỉ được lấy ở 3 địa điểm khác nhau, địa diểm thứ nhất là ở cụm công nghiệp – làng nghề Tịnh Ân Tây, xã Tịnh Ân Tây, thành phố Quảng Ngãi, Tỉnh Quảng Ngái, địa điểm thứ hai là ở khu vực viện sông nghệ sinh học và môi trường, trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và địa điểm thứ 3 là ở khu dân cư, thuộc đường 17, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Mẫu lá dương xỉ sau khi lấy cho vào túi nilon sạch, đóng kín miệng túi nilon lại và ghi rõ địa điểm, thời gian lấy mẫu.
Lưu mẫu trong tủ mát 20oC.
3.3.2. Phân lập vi khuẩn
- Mẫu lá cây dương xỉ sau khi mang về sẽ được xử lý bề mặt cho sạch khuẩn, sau đó dùng chày và cối nghiền nhỏ mẫu ra để thu lấy dịch.
Thí nghiệm 2
Nhuộm Gram, quan sát hình thái, thực hiện một số phản ứng sinh hóa Thí nghiệm 3 Phân tích trình tự 16S rDNA Thí nghiệm 4 Xác định gen arsC bằng phương pháp PCR
- Pha loãng dịch mẫu thu được ra ba nồng độ khác nhau là 10-1; 10-2 và 10-3, mỗi nồng độ sẽ cấy trang lên ba đĩa môi trường TYEG có bổ sung arsenat nồng độ 1mM, ủ đĩa trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ – 48 giờ.
- Chọn những vi khuẩn phát triển được, tiếp tục cấy chuyền những vi khuẩn đó ở những nồng độ cao hơn 3 mM, 5 mM, 7 mM.
- Sau đó chọn những khuẩn lạc phát triển ở nồng độ arsenate cao nhất, cấy thuần lại ít nhất ba lần để có những khuẩn lạc đơn.
- Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường LB ở 37oC từ 24 đến 48 giờ.
- Hút 0,8 ml dung dịch tăng sinh vi khuẩn với 0,2 ml dung dịch Glycerol cho vào ống tupe 1,5 ml, trộn đều và giữ giống trong tủ - 20oC.
3.3.3. Định danh vi khuẩn
3.3.3.1. Định danh bằng các phản ứng sinh hóa
Nhuộm Gram: Thực hiện theo phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram. Nguyên tắc: Dựa vào khả năng lưu giữ phẩm màu Crystal Violet trên thành tế bào vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn. Vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crytal Violet được gắn chắc vào thành tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử bởi cồn. Do đó vẫn giữ được màu của thuốc nhuộm ban đầu. Còn vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn), nhưng lại có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bị hòa tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt với màu hồng đỏ của thuốc nhuộm Fuschin.
Như vậy sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram âm có màu hồng đỏ, còn vi khuẩn Gram dương có màu tím.
Thực hiện
- Cố định vết bôi vi khuẩn trên lam kính và hơ nhẹ dưới ngọn lửa đèn cồn
- Nhuộm bằng Crystal Violet trong 1 phút, rửa nhẹ lại bằng nước
- Nhuộm với lugol trong 1 phút, rửa bằng nước
- Rửa bằng cồn cho tới khi giọt cồn nhỏ xuống không có màu (khoảng 30 giây)
- Nhuộm safranin trong 45 giây
- Rửa lại bằng nước
- Để khô, quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi Khả năng di động
Nguyên tắc: Vi khuẩn có thể di động nhờ cấu trúc protein, gọi là tiêm mao (ilagella). Đây có thể là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt các vi sinh vật. Thử nghiệm trong mồi trường bán rắn. Nấu vi khuẩn mọc theo đường cấy và lan ra cả bên ngoài đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động. Ngược lại, nếu vi khuẩn chỉ mọc theo đường cấy mà không lan ra ngoài thì không có khả năng di động.
Thực hiện: Dùng que cấy thẳng cho vào dịch tăng sinh vi khuẩn đã lắc 1 – 2 ngày, sau đó cấm que cấy vào ống nghiệm chứa môi trường bán lỏng. Ủ ống nghiệm trong tủ ấm 37oC trong 1 – 2 ngày, quan sát và ghi nhận kết quả kết quả.
Khảo sát hoạt tính catalase
Nguyên tắc: Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2), thành H2O và giải phóng oxy, gây hiện tượng sủi bọt khí.
Thực hiện: nhỏ vài giọt H2O2 lên khuẩn lạc của vi khuẩn đã bôi trên lam kính. Quan sát và ghi nhận hiện tượng sủi bọt khí.
Khảo sát oxydase
Nguyên tắc: Cytochrome Oxydase là thành phần quan trọng trong chuỗi chuyển điện tử hô hấp, với O2 là chất nhận điện tử cuối cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý. Hoạt tính này được phát hiện nhờ thuốc thử p- phenylenediamine bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol màu xanh dương.
Thực hiện: Dàn đều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm tetramethyl-p- phenylenediamine dihydrochloride. Quan sát và ghi nhận kết quả, có sự chuyển đồi sang màu xanh dương là kết quả dương tính, không đồi màu là âm tính.
Thử nghiệm VP
Nguyên tắc: Trong điều kiện có oxy và pH kiềm , 2,3-butanediol bị chuyển hóa thành acetonin, và acetonin tiếp tục bị oxy hóa thành cetyl dưới sự xúc tác của α- naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton kết tụ thành phức diacetyl- guanidine có màu đỏ.
Môi trường và thuốc thử Môi trường Clark – Lubs
Thuốc thử gồm 2 loại hóa chất: KOH 10% (hoặc NaOH 40%) và α – naphtol 10% trong cồn.
Thực hiện: Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn cấy vào môi trường lỏng Clark-Lubs, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau 24 giờ, trong ống nghiệm chứa 3 ml canh trùng, cho vào 0,5 ml KOH 105 (hoặc NaOK 40%), sau đó nhỏ thêm vài giọt α-naphtol 10%,lắc kỹ. Sau vài phút nếu môi trường chuyển sang màu hồng nhạt thì kết quả là VP dương tính, môi trường không có màu hồng nhạt, kết quả VP âm tính.
Khả năng chuyển hóa citrat
Nguyên tắc: Xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat là nguồn hydratcarbon. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và thay đổi màu của chị thị màu.
Môi trường và chất chỉ thị
Môi trường thạch nghiêng simmons citrat Chất chỉ thị màu: xanh bromothymol
Thực hiện: Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch nghiêng simmons citrat, ủ môi trường ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó quan sát màu của môi trường, môi trường đổi màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển, tức là pH của môi trường tăng, vi khuẩn đã sử dụng được citrat, thì kết quả là dương tính. Môi trường không đổi màu, tức là pH môi trường không tăng, vi khuẩn không sử dụng được citrat, cho kết quả âm tính.
Khả năng phân giải tinh bột
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng màu giữa lugol và tinh bột. Bình thường, khi cho dung dịch lugol lên tinh bột sẽ thấy màu tím xuất hiện. Trong trường hợp khi ta nhỏ dung
dịch lugol vào môi trường có chứa tinh bột đã nuôi cấy vi khuẩn mà không thấy màu tím xuất hiện nữa, có nghĩa là tinh bột đã bị phân giải bởi enzyme amylase được sinh ra bởi vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột thành đường để sử dụng làm nguồn dinh dưỡng.
Môi trường và thuốc thử
Môi trường thạch pepton có chứa 0,2% tinh bột tan, được đổ vào đĩa petri. Thuốc thử: Dung dịch lugol
Thực hiện: Dùng que cấy theo phương pháp vô trùng cấy điểm vi khuẩn vào đĩa petri. Nuôi cấy ở 37oC ít nhất 3 đến 4 ngày. Sau đó nhỏ dung dịch lugol lên khóm vi khuẩn, quan sát và ghi nhận sự chuyển đổi màu xung quanh khóm vi khuẩn. Nếu không thấy sự đổi màu xung quanh khóm vi khuẩn, có nghĩa là tinh bột đã bị phân giải bởi enzyme amylase của vi khuẩn, ghi nhận kết quả dương tính. Còn nếu có sự xuất hiện màu xung quanh khóm vi khuẩn, tinh bột không bị phân giải, vi khuẩn không có enzyme amylase, ghi nhận kết quả âm tính.
3.3.3.2. Định danh bằng phương pháp PCR
Hiện nay phương pháp PCR là phương pháp được sử dụng phổ biến để định danh các loài vi khuẩn thông qua giải trình tự DNA của chúng. Phương pháp PCR cho phép xác định vi khuẩn có khả năng kháng chịu được asen thông qua xác định bởi trình tự và phân tích gen 16S rDNA.
Phân tử rDNA 16S là một công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi sinh vật. Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các vi sinh vật, phân tử rDNA 16S còn có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng từng nhóm vi sinh vật, đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ có kích thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự.
Trước khi giải trình tự đoạn gen mong muốn, ta cần khuếch đại chúng bằng phương pháp PCR, PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA từ mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn