3.2.3.1.Môi trường và hóa chất dùng cho phương pháp nuôi cấy
- Môi trường TYEG
- Dung dịch tăng sinh vi khuẩn
- Môi trường dùng trong các phản ứng sinh hóa
3.2.3.2. Môi trường và hóa chất dùng cho phản ứng PCR
- CH3COONa - TE Buffer - Ethanol
- PCR Master Mix
3.3. Phương pháp nghiên cứu
Nguồn mẫu
Thí nghiệm 1
Phân lập và tuyển chọn những vi khuẩn sống trong môi trường có arsenat
Chọn những vi khuẩn chống chịu nồng độ arsenat cao để định danh
Những chủng vi khuẩn đã qua sàn lọc
Kết luận
Hình 3.3 Các bước thí nghiệm. 3.3.1. Lấy mẫu
Mẫu lá cây dương xỉ được lấy ở 3 địa điểm khác nhau, địa diểm thứ nhất là ở cụm công nghiệp – làng nghề Tịnh Ân Tây, xã Tịnh Ân Tây, thành phố Quảng Ngãi, Tỉnh Quảng Ngái, địa điểm thứ hai là ở khu vực viện sông nghệ sinh học và môi trường, trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và địa điểm thứ 3 là ở khu dân cư, thuộc đường 17, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Mẫu lá dương xỉ sau khi lấy cho vào túi nilon sạch, đóng kín miệng túi nilon lại và ghi rõ địa điểm, thời gian lấy mẫu.
Lưu mẫu trong tủ mát 20oC.
3.3.2. Phân lập vi khuẩn
- Mẫu lá cây dương xỉ sau khi mang về sẽ được xử lý bề mặt cho sạch khuẩn, sau đó dùng chày và cối nghiền nhỏ mẫu ra để thu lấy dịch.
Thí nghiệm 2
Nhuộm Gram, quan sát hình thái, thực hiện một số phản ứng sinh hóa Thí nghiệm 3 Phân tích trình tự 16S rDNA Thí nghiệm 4 Xác định gen arsC bằng phương pháp PCR
- Pha loãng dịch mẫu thu được ra ba nồng độ khác nhau là 10-1; 10-2 và 10-3, mỗi nồng độ sẽ cấy trang lên ba đĩa môi trường TYEG có bổ sung arsenat nồng độ 1mM, ủ đĩa trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ – 48 giờ.
- Chọn những vi khuẩn phát triển được, tiếp tục cấy chuyền những vi khuẩn đó ở những nồng độ cao hơn 3 mM, 5 mM, 7 mM.
- Sau đó chọn những khuẩn lạc phát triển ở nồng độ arsenate cao nhất, cấy thuần lại ít nhất ba lần để có những khuẩn lạc đơn.
- Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường LB ở 37oC từ 24 đến 48 giờ.
- Hút 0,8 ml dung dịch tăng sinh vi khuẩn với 0,2 ml dung dịch Glycerol cho vào ống tupe 1,5 ml, trộn đều và giữ giống trong tủ - 20oC.
3.3.3. Định danh vi khuẩn
3.3.3.1. Định danh bằng các phản ứng sinh hóa
Nhuộm Gram: Thực hiện theo phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram. Nguyên tắc: Dựa vào khả năng lưu giữ phẩm màu Crystal Violet trên thành tế bào vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn. Vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crytal Violet được gắn chắc vào thành tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử bởi cồn. Do đó vẫn giữ được màu của thuốc nhuộm ban đầu. Còn vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn), nhưng lại có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bị hòa tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt với màu hồng đỏ của thuốc nhuộm Fuschin.
Như vậy sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram âm có màu hồng đỏ, còn vi khuẩn Gram dương có màu tím.
Thực hiện
- Cố định vết bôi vi khuẩn trên lam kính và hơ nhẹ dưới ngọn lửa đèn cồn
- Nhuộm bằng Crystal Violet trong 1 phút, rửa nhẹ lại bằng nước
- Nhuộm với lugol trong 1 phút, rửa bằng nước
- Rửa bằng cồn cho tới khi giọt cồn nhỏ xuống không có màu (khoảng 30 giây)
- Nhuộm safranin trong 45 giây
- Rửa lại bằng nước
- Để khô, quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi Khả năng di động
Nguyên tắc: Vi khuẩn có thể di động nhờ cấu trúc protein, gọi là tiêm mao (ilagella). Đây có thể là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt các vi sinh vật. Thử nghiệm trong mồi trường bán rắn. Nấu vi khuẩn mọc theo đường cấy và lan ra cả bên ngoài đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động. Ngược lại, nếu vi khuẩn chỉ mọc theo đường cấy mà không lan ra ngoài thì không có khả năng di động.
Thực hiện: Dùng que cấy thẳng cho vào dịch tăng sinh vi khuẩn đã lắc 1 – 2 ngày, sau đó cấm que cấy vào ống nghiệm chứa môi trường bán lỏng. Ủ ống nghiệm trong tủ ấm 37oC trong 1 – 2 ngày, quan sát và ghi nhận kết quả kết quả.
Khảo sát hoạt tính catalase
Nguyên tắc: Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2), thành H2O và giải phóng oxy, gây hiện tượng sủi bọt khí.
Thực hiện: nhỏ vài giọt H2O2 lên khuẩn lạc của vi khuẩn đã bôi trên lam kính. Quan sát và ghi nhận hiện tượng sủi bọt khí.
Khảo sát oxydase
Nguyên tắc: Cytochrome Oxydase là thành phần quan trọng trong chuỗi chuyển điện tử hô hấp, với O2 là chất nhận điện tử cuối cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý. Hoạt tính này được phát hiện nhờ thuốc thử p- phenylenediamine bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol màu xanh dương.
Thực hiện: Dàn đều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm tetramethyl-p- phenylenediamine dihydrochloride. Quan sát và ghi nhận kết quả, có sự chuyển đồi sang màu xanh dương là kết quả dương tính, không đồi màu là âm tính.
Thử nghiệm VP
Nguyên tắc: Trong điều kiện có oxy và pH kiềm , 2,3-butanediol bị chuyển hóa thành acetonin, và acetonin tiếp tục bị oxy hóa thành cetyl dưới sự xúc tác của α- naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton kết tụ thành phức diacetyl- guanidine có màu đỏ.
Môi trường và thuốc thử Môi trường Clark – Lubs
Thuốc thử gồm 2 loại hóa chất: KOH 10% (hoặc NaOH 40%) và α – naphtol 10% trong cồn.
Thực hiện: Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn cấy vào môi trường lỏng Clark-Lubs, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau 24 giờ, trong ống nghiệm chứa 3 ml canh trùng, cho vào 0,5 ml KOH 105 (hoặc NaOK 40%), sau đó nhỏ thêm vài giọt α-naphtol 10%,lắc kỹ. Sau vài phút nếu môi trường chuyển sang màu hồng nhạt thì kết quả là VP dương tính, môi trường không có màu hồng nhạt, kết quả VP âm tính.
Khả năng chuyển hóa citrat
Nguyên tắc: Xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat là nguồn hydratcarbon. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và thay đổi màu của chị thị màu.
Môi trường và chất chỉ thị
Môi trường thạch nghiêng simmons citrat Chất chỉ thị màu: xanh bromothymol
Thực hiện: Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch nghiêng simmons citrat, ủ môi trường ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó quan sát màu của môi trường, môi trường đổi màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển, tức là pH của môi trường tăng, vi khuẩn đã sử dụng được citrat, thì kết quả là dương tính. Môi trường không đổi màu, tức là pH môi trường không tăng, vi khuẩn không sử dụng được citrat, cho kết quả âm tính.
Khả năng phân giải tinh bột
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng màu giữa lugol và tinh bột. Bình thường, khi cho dung dịch lugol lên tinh bột sẽ thấy màu tím xuất hiện. Trong trường hợp khi ta nhỏ dung
dịch lugol vào môi trường có chứa tinh bột đã nuôi cấy vi khuẩn mà không thấy màu tím xuất hiện nữa, có nghĩa là tinh bột đã bị phân giải bởi enzyme amylase được sinh ra bởi vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột thành đường để sử dụng làm nguồn dinh dưỡng.
Môi trường và thuốc thử
Môi trường thạch pepton có chứa 0,2% tinh bột tan, được đổ vào đĩa petri. Thuốc thử: Dung dịch lugol
Thực hiện: Dùng que cấy theo phương pháp vô trùng cấy điểm vi khuẩn vào đĩa petri. Nuôi cấy ở 37oC ít nhất 3 đến 4 ngày. Sau đó nhỏ dung dịch lugol lên khóm vi khuẩn, quan sát và ghi nhận sự chuyển đổi màu xung quanh khóm vi khuẩn. Nếu không thấy sự đổi màu xung quanh khóm vi khuẩn, có nghĩa là tinh bột đã bị phân giải bởi enzyme amylase của vi khuẩn, ghi nhận kết quả dương tính. Còn nếu có sự xuất hiện màu xung quanh khóm vi khuẩn, tinh bột không bị phân giải, vi khuẩn không có enzyme amylase, ghi nhận kết quả âm tính.
3.3.3.2. Định danh bằng phương pháp PCR
Hiện nay phương pháp PCR là phương pháp được sử dụng phổ biến để định danh các loài vi khuẩn thông qua giải trình tự DNA của chúng. Phương pháp PCR cho phép xác định vi khuẩn có khả năng kháng chịu được asen thông qua xác định bởi trình tự và phân tích gen 16S rDNA.
Phân tử rDNA 16S là một công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi sinh vật. Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các vi sinh vật, phân tử rDNA 16S còn có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng từng nhóm vi sinh vật, đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ có kích thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự.
Trước khi giải trình tự đoạn gen mong muốn, ta cần khuếch đại chúng bằng phương pháp PCR, PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA từ mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis và ctv (Mỹ) phát minh năm 1985.
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này sẽ được nối dài để hình thành mạch mới. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành một số lượng lớn bản sao.
Quy trình tăng sinh vi khuẩn
Cho vào ống nghiệm 20 ml dung dịch LB
Lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn cho vào môi trường trong từng ống nghiệm Ủ lắc môi trường tăng sinh ở 37oC trong 24 – 48 giờ.
Quy trình ly trích Genomic DNA từ vi khuẩn bằng phương pháp Boiling
- Hút 1 ml dịch khuẩn từ bình tăng sinh cho vào ống tube 1,5 ml, ly tâm 8000 vòng/phút trong 3 phút. Lập lại bước này 3 lần.
- Thêm 300µl TE Buffer, vontex trộn đều tế bào vi khuẩn. - Cho ống tube vào nước sôi 100oC từ 10 – 20 phút.
- Ủ đá trong 5 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Hút 200µl dịch nổi phía trên cho vào ống tube 1,5 ml mới, cho thêm 20µl CH3COONa + 600µl Ethanol 70%, ủ trong tủ -20oC trong 1 – 2 giờ.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi, để khô tự nhiên trong 10 phút, sau đó thêm 30- 50µl TE buffer hoặc nước cất khử ion.
- Bảo quản DNA ở -20oC.
Khuếch đại trình tự 16S rDNA bằng phản ứng PCR
Để có thể định danh một cách chính xác các chủng vi khuẩn phân lập được ở mức độ loài thì ta phải biết thông tin về trình tự đủ để mã hóa cho phân tử rDNA 16S. Do đó ta cần tiến hành phương pháp PCR để khuếch đại toàn bộ trình tự rDNA 16S từ khuôn là DNA bộ gen vi khuẩn phân lập được. Phản ứng PCR thực hiện với cặp mồi: 63F 5’ –
CAGGCCTAACACATGCAAGTC- 3’ VÀ 1489R 5’ TACCTTGTTAFFACTTCA- 3’ (Bruneel và ctv, 2006).
Thành phần phản ứng PCR (thể tích 25 µl)
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 16S rDNA và PCR arsC
STT Tên hóa chất Thể tích đầu
1 Promega 12,5 µl 2 Primer Forward 1,9 µl 3 Primer Reverse 1,9 µl 4 DNA 2 µl 5 Nước cất khử ion 6,7 µl Tổng 25 l Quy trình chạy PCR
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 16S rDNA
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
PCR 950 C 2 phút 35 chu kỳ 950 C 30 giây 530 C 30 giây 720 C 2 phút 720 C 5 phút
Bảo quản 40 C Phản ứng PCR xác định gen arsC
Gen arsC là một gen nằm trong operon ars của những vi khuẩn kháng được Asen. Những vi khuẩn này không dùng được Asen như một nguồn năng lượng mà chúng thực hiện việc kháng Asen theo cơ chế chống Asen ở nơi Asen xâm nhập vào tế bào qua quá trình giảm xuống Asen (III), và loại bỏ ra khỏi tế bào. Những operon ars này giải độc Asen bằng việc chịu trách nhiệm cho việc chuyển Asen (III) được tạo thành (Macur và ctv, 2001: Kaur và ctv, 2009). Một vài loài vi khuẩn được biết có thể oxy hóa Asen (III) thành Asen (V) do sử dụng hệ thống enzyme của quá trình hô hấp và không hô hấp (Orenland và Stolz, 2003). Một enzyme oxidase Asen (III) trên mặt ngoài của màng tế bào thực hiện quá trình oxy hóa này (Ilyaledinov và Abdrashitova, 1981).
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR arsC
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
PCR 950 C 2 phút 35 chu kỳ 950 C 30 giây 600 C 30 giây 720 C 2 phút 720 C 5 phút Bảo quản 40 C Đọc kết quả
- Bước 1: Chuẩn bị dung dịch agarose 1% trong TBE buffer 0,5X. đun nóng dung dịch agarose 1% tan ra trong 2 phút. Để nguội dung dịch đến 60oC, đổ gel vào khuôn đã cắm lược trước đến độ dày vừa ý, để yên cho tới khi gel đông lại và tháo lược ra. Đổ dung dịch chạy diện di TBE 0,5X vào bồn điện di có chứa gel agarose.
- Bước 2: Mix mẫu.
- Bước 3: Chạy điện di ở 100V trong 20 phút.
- Cho miếng gel vừa chạy điện di xong vào buồng chiếu tia UV. Chụp ảnh gel để lưu kết quả.
Lưu mẫu phân lập vi khuẩn
- Hút 800 µl dịch vi khuẩn sau khi được tăng sinh trong môi trường LB lỏng cho vào ống tube 1,5 ml sạch, cho thêm 200 µl dung dịch Glycerol, sau đó trộn hỗn hợp trên bằng máy vottex để tế bào vi khuẩn trộn đều với glycerol.
- Lưu mẫu trong tủ - 20oC.
Lưu mẫu DNA ly trích từ vi khuẩn
Mẫu DNA sau khi ly trích được bảo quản trong tủ - 20oC. Lưu mẫu sản phẩn PCR
Sản phẩm PCR sau khi chạy được bảo quản trong tủ mát - 20oC. Giải trình tự và và phân tích trình tự rDNA 16S
Những mẫu có kết quả PCR sẽ được gửi mẫu giải trình tự tại phòng xét nghiệm Nam Khoa, Công ty trách nhiệm hữu hạng và thương mại Nam Khoa ở địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn – Quận 7 – thành phố Hồ Chí Minh.
Kết quà giải trình tự sẽ được xử lý bằng phần mềm fastPRC để tạo ra các trình tự rDNA nguyên vẹn của mỗi chủng vi khuẩn. Trình tự rDNA 16S này sẽ được so sánh với trình tự DNA của vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu NCBI thông qua phần mềm BLAST.
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập
Qua quá trình phân lập vi khuẩn trong lá cây dương xỉ trên môi trường TYEG có bổ sung nồng độ arsenat tăng dần. Ở nồng độ arsenat thấp, số lượng vi khuẩn ở cả 3 địa điểm lấy mẫu đều là rất nhiều, sau quá trình sàng lọc, tăng nồng độ asenat lên thì số lượng vi