4. Ph ạm vi nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu mẫu và tách DNA tổng số
2.2.1.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu máu được thu nhận bởi bác sỹ thú y, trước khi lấy mẫu cần chuẩn bị các
dụng cụ sau: kéo, kim tiêm, cồn 70%, bông gòn, viết, ống EDTA vacutainer, thùng
- Sát trùng vùng lấy máu bằng bông có thấm cồn 70%.
- Dùng kim tiêm vô trùng rút 2 mL máu từ tĩnh mạch chân trước của chó, chuyển
nhanh vào ống EDTA vacutainer, lắc đều để máu hòa tan hoàn toàn với EDTA để
tránh tình trạng máu bị đông.
- Ghi thông tin của mẫu lên thành ống EDTA vacutainer và chụp ảnh của các con
chó vừa lấy mẫu.
- Cho mẫu vào thùng xốp giữ nhiệt có túi đá khô để giữ lạnh mẫu trong quá trình vận
chuyển, cần nhanh chóng chuyển mẫu vào tủ lạnh – 20 oC để mẫu được bảo quản
tốt nhất.
2.2.1.2. Phương pháp tách DNA tổng số
Nguyên tắc chung: Màng tế bào được phá vỡ bằng chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó protein được tinh sạch bằng
proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Cuối cùng
DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm.
Yêu cầu: DNA tách chiết cần phải đảm bảo về độ tinh sạch và độ nguyên vẹn về
cấu trúc để thực hiện cho các thí nghiệm về sinh học phân tử.
DNA tổng số được tách chiết từ những mẫu máu đã chống đông bằng EDTA
theo quy trình của FBI (Roe, 1995). Mẫu máu thường được thu là 1 – 2 mL máu toàn
bộ được lưu trữ trong ống EDTA vacutainer đông lạnh ở -20 oC. Quy trình tách chiết
DNA tổng số được thực hiện như sau:
Bước 1: Làm tan các mẫu đông lạnh và mỗi 1V mẫu thêm vào 0,8V dung dịch đêm SSC 1X, trộn đều, ly tâm ở 12000 rpm trong 20 phút.
Bước 2: Loại bỏ 1V phần nổi và thêm vào dung dịch chất khử trùng.
Bước 3: Thêm vào 1V dung dịch đệm SSC 1X, vortex, ly tâm ở 12000 rpm trong 20 phút và loại bỏ hoàn toàn phẩn nổi.
Bước 4: Thêm 0,375V NaOAc 0,2M vào mỗi kết tủa và vortex trong thời gian
ngắn. Thêm 0,025V dung dịch SDS 10% và 0,005 V proteinase K (20 mg/mL H2O),
vortex trong thời gian ngắn, ủ ở 55 o
C trong 1 giờ.
Bước 5: Thêm 0,12V dung dịch hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) và vortex trong 30 giây. Ly tâm 12000 rpm trong 20 phút.
Bước 6: Chuyển lớp nước bên trên sang ống Ep 1,5 mL mới một cách cẩn thận.
Thêm 1V dung dịch EtOH tuyệt đối lạnh (ethanol 100% lạnh), trộn đều và ủ ở -20 o
C trong 15 phút.
Bước 7: Ly tâm 12000 rpm trong 20 phút, gạn bỏ phần nổi trên mặt và để ráo.
Bước 8: Thêm 0,18V dung dịch TE buffer 10:1, vortex, ủ ở 55 o
C trong 10 phút.
Bước 9: Thêm 0,02V dung dịch NaOAc 2M và trộn đều, thêm 0,5V dung dịch
EtOH tuyệt đối lạnh, trộn đều và ly tâm 12000 rpm trong 1 phút.
Bước 10: Gạn bỏ phần nổi và rửa phần tủa với 1V dung dịch EtOH 80%, ly tâm 12000 rpm trong 1 phút.
Bước 11: Gạn bỏ phần nổi và làm khô phần tủa.
Bước 12: Huyền phù phần tủa bằng cách thêm vào 0,2V dung dịch TE buffer
10:1. Ủ qua đêm ở 55 o
C, vortexing định kỳ để làm tan toàn bộ DNA bộ gen. Trữ mẫu
ở -20 o
C
Quy trình tách chiết DNA tổng số hiệu chỉnh được thực hiện như sau:
Bước 1: Làm tan các mẫu đông lạnh và thêm 0,002V β-mercaptoethanol vào mỗi
1V mẫu. Thêm vào 0,8V dung dịch đêm SSC 1X, trộn đều, ly tâm ở 12000 rpm trong
20 phút.
Bước 3: Thêm vào 1V dung dịch đệm SSC 1X, vortex, ly tâm ở 12000 rpm trong 20 phút và loại bỏ hoàn toàn phẩn nổi.
Bước 4: Thêm 0,375V NaOAc 0,2M vào mỗi kết tủa và vortex trong thời gian
ngắn. Thêm 0,025V dung dịch SDS 10% và 0,005V proteinase K (20 mg/mL H2O),
vortex trong thời gian ngắn, ủ ở 55 oC trong 1 giờ.
Bước 5: Thêm hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) với thể tích tương đương với thể tích dung dịch có trong ống và vortex trong 30 giây. Ly tâm 12000 rpm trong 20 phút. Chuyển lớp nước bên trên sang ống Ep 1,5 mL mới một cách cẩn thận (lặp lại 2-3 lần).
Bước 6: Thêm 1V dung dịch EtOH tuyệt đối lạnh (ethanol 100% lạnh), trộn đều và ủ ở -20 o
C trong 60 phút.
Bước 7: Ly tâm 12000 rpm trong 20 phút, gạn bỏ phần nổi trên mặt và để ráo.
Bước 8: Thêm 0,18V dung dịch TE buffer 10:1, vortex, ủ ở 55o
C trong 10 phút.
Bước 9: Thêm 0,02V dung dịch NaOAc 2M và trộn đều, thêm 0,5V dung dịch
EtOH tuyệt đối lạnh, trộn đều và ly tâm 12000 rpm trong 1 phút.
Bước 10: Gạn bỏ phần nổi và rửa phần tủa với 1V dung dịch EtOH 80%, ly tâm 12000 rpm trong 1 phút.
Bước 11: Gạn bỏ phần nổi và làm khô phần tủa ở nhiệt độ phòng.
Bước 12: Huyền phù phần tủa bằng cách thêm vào 0,2V dung dịch TE buffer
10:1, trộn đều. Trữ mẫu ở -20 o
C.
2.2.1.3. Kiểm tra dịch chiết bằng quang phổ kế
Pha loãng dịch chiết DNA trong nước cất để đạt độ pha loãng 200 lần. Tiến hành
Cách tính nồng độ DNA khi đo quang:
A260=1 tương ứng với 50 ng/µL.
Nồng độ DNA (ng/µL) = Số đơn vị A260 x 50 x độ pha loãng
Vậy: Nồng độ DNA (ng/µL) = A260 x 10000
DNA tinh sạch được bảo quản ở -20 oC đến khi dùng.