5. Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài
3.5. Một số gene mã hóa enzyme carbapenemase được phát hiện ở Pseudomonas
Pseudomonas aeruginosa
Chúng tôi tiến hành khảo sát 28 chủng, nhằm phát hiện các chủng có mang gene mã hóa cho khả năng sản xuất enzyme carbapenemase bằng kỹ thuật PCR, với 3 genen mục tiêu đã chọn là blaVIM2, blaSIM1, blaNDN-1. Đây là những gene được xác định đã xuất hiện ở nhiều quốc gia khác nhau và đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu.
Kết quả thu được: có 3 chủng mang gene blaVIM2 trong tổng số 28 chủng (chiếm 10,7%), số chủng mang gen blaSIM1 là 2 (chiếm 7,1%) và số chủng mang gene blaNDN-1 là 1 (chiếm 3,8%).
Bảng 3.5. Kết quả PCR phát hiện gene mã hóa cho enzyme carbapenemase
Gene Số chủng khảo sát Số chủng mang gene Tỉ lệ (%) số chủng mang gene Kích thước gene mục tiêu blaVIM2 28 3 10,7% 390bp blaSIM1 28 2 7,1% 570pb blaNDN-1 28 1 3,8% 127pb
78
Khi đối chiếu kết quả PCR và kết quả của thử nghiệm Hogde test, chúng tôi nhận thấy các chủng được xác định mang gene đều dương tính với thử nghiệm Hogde test, trong đó có 2 chủng cùng mang gene blaVIM2 và Gene blaSIM1 (chủng số 473). Như vậy, có 5 trong tổng số 6 chủng dương tính với thử nghiệm Hogde test đã được xác định mang gene mã hóa cho enzym carbapenemase với các gene khảo sát, điều này chứng tỏ hiệu quả của việc bổ sung 10µ ZnSO4 (0,5M) trong thử nghiệm Hodge test. Tuy nhiên 1 chủng còn lại biểu hiện âm tính với PCR có thể giải thích rằng đặc điểm này được mã hóa bởi một gene khác, vì có rất nhiều gene có khả năng mã hóa cho khả năng sản xuất carbapenemase của P. aeruginosa. Trong phạm vi giới hạn của đề tài, chúng tôi chỉ có thể khảo sát được 3 gene, nếu được nghiên cứu sâu hơn và thời gian nghiên cứu dài hơn nữa, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu xem các chủng P. aeruginosa còn mang những gene nào khác nữa.
Bảng 3.6. Đối chiếu kết quả Hodge test với kết quả PCR ở các chủng dương tính STT Chủng Kết quả khảo sát kháng sinh IPM
Kết quả Hodge test Kết quả PCR Hodge test truyền thống Hodge test bổ sung ZnSO4
blaVIM2 blaSIM1 blaNDN-1
2 827 R - + - - - 8 919 R - + - + - 9 793 R + + - - + 10 405 R + + + - - 12 473 R + + + + - 13 182 R - + + - -
79
3.5.1. Gene blaVIM2
Gene blaVIM2 mã hóa cho enzyme VIM2, enzyme VIM (Verona integron- encoded metallo-beta-lactamases) gồm tập hợp các enzyme lớp MBL, hiện nay đã phát hiện được 10 enzyme VIM, được ký hiệu từ VIM1 đến VIM10. VIM1 lần đầu tiên được phân lập ở Verona, Italy vào năm 1997, VIM2 được phát hiện ở pháp năm 1996, cả hai enzyme này ban đầu đều được phát hiện từ P. aeruginosa. Theo các kết quả nghiên cứu của Mahnaz Sarhangi và cộng sự [49], Matthew J.Ellington và cộng sự [51], Anis Karuniawati và cộng sư [26], chúng tôi đã lựa chọn được cặp mồi để khuếch đại một đoạn gene có kích thước 390bp. Chúng tôi tiến hành PCR và điện di sản phẩm thu được kết quả hình 3.2.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi xác định được, trong số 28 chủng P. aeruginosa được khảo sát có 3 chủng (10,7%) mang gene blaVIM2. Kết quả của chúng tôi cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của Mahnaz Sarhangi và cộng sự là 12,2% [49], Matthew J.Ellington và cộng sự 13,3% [51]. Điều này chứng tỏ sự phổ biến của gen blaVIM2 trong các chủng P. aeruginosa hiện nay và sự gia tăng mức độ kháng thuốc của các chủng này.
80
Hình 3.2. Kết quả điện di gene blaVIM2
390bp 100bp
81
3.5.2. Gene blaSIM1
Gene blaSIM1 mã hóa cho enzyme SIM1 (Seoul imipenemase) được phát hiện lần đầu tiên tại Soeul, Hàn Quốc. Theo các kết quả nghiêm cứu của Mahnaz Sarhangi và cộng sự [49], Matthew J.Ellington và cộng sự [51], Afzal Azim và cộng sự [30], chúng tôi đã lựa chọn được cặp mồi để khuếch đại một đoạn gene có kích thước 570bp bằng phản ứng PCR và tiến hành điện di thu được kết quả hình 3.3.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, 28 chủng P. aeruginosa khảo sát có 2 chủng được xác định là mang gen blaSIM1, chiếm tỉ lệ 7,2%. Trong nghiên cứu của Sarhangi và cộng sự [51], Matthew J.Ellington và cộng sự [30] chưa xác định được các chủng có mang gene blaSIM1 trong số chủng khảo sát. Kết quả này chứng tỏ, ở TP. Hồ Chí Minh nói riêng và ở Việt Nam nói chung đã xuất hiện các chủng P. aeruginosa có mang gen blaSIM1. Điều này cần phải được quan tâm giám sát và nghiên cứu sâu hơn, để có biện pháp ngăn ngừa sự lây lan các gene kháng kháng sinh của P. aeruginosa.
82
Hình 3.3. Kết quả điện di gene blaSIM1
570bp
100bp 100bp
83
3.5.3. Gene blaNDN1
Gene blaNDN-1 mã hóa cho enzyme New Delhi metallo – β - lactamase (NDN1) NDM-1 là enzym mới được Yong D và cộng sự công bố lần đầu tiên năm 2008 đã thu hút được sự quan tâm một cách mạnh mẽ của các nhà khoa học, các chính trị gia và công chúng do các chủng vi khuẩn mang gen blaNDM-1 kháng carbapenem là nhóm kháng sinh mạnh nhất hiện nay và hiện chưa có kháng sinh thay thế và gen blaNDM-1 có khả năng truyền nhanh chóng cho các loài vi khuẩn thông qua các plasmid. Tại châu Âu từ 2008 đến 2010 có 13 quốc gia phát hiện được 77 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen blaNDM-1. Hiện nay nhiều quốc gia trên thế giới đã công bố sự có mặt của vi khuẩn mang gen
blaNDM-1 như Úc, Trung quốc và Mỹ [10].
Theo kết quả nghiên cứu của Danny C. T. Ong và cộng sự [37], chúng tôi đã
lựa chọn được cặp mồi để khuếch đại đoạn gene có kích thước 127bp. Kết quả thu
được (hình 3.4), trong số 28 chủng khảo sát có 1 chủng (chiếm tỉ lệ 3,8%) được xác
định có mang gene blaNDN-1. Việc phát hiện các chủng P. aeruginosa có mang gene
blaNDN-1 chứng tỏ sự lan truyền nhanh chóng của gene này và mức độ kháng kháng sinh của P. aeruginosangày càng gia tăng.
84
Hình 3.4. Kết quả điện di gene blaNDN-1
100bp 127bp
100bp
85
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luậnQua việc khảo sát khả năng kháng kháng sinh của P. aeruginosa tại viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2014, chúng tôi rút ra kết luận:
1.1. Đặc tính mẫu
- Từ các mẫu bệnh phẩm của các bệnh có biểu hiện nhiễm trùng tại viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, chúng tôi phân lập được 680 mẫu bệnh phẩm, định danh và thực hiện khảo sát kháng sinh đồ được 58 chủng P. aeruginosa, tiến hành thử nghiệm Hodge test được 36 chủng và tiến hành phản ứng PCR để xác định gene mã hóa enzyme carbapenemase cho 28 chủng.
- Tỉ lệ bệnh nhân nam nhiễm P. aeruginosa cao hơn so với bệnh nhân nữ: tỉ lệ bệnh nhân nhiễm P. aeruginosa ở nam giới là 65,5% trong khi tỉ lệ nhiễm ở bệnh nhân nữ là 34,5%.
- Độ tuổi nhiễm khuẩn bệnh viện bởi tác nhân P. aeruginosa chủ yếu là những bệnh nhân lớn tuổi: bệnh nhân từ 30-59 tuổi chiếm tới 50%, đặc biệt tỉ lệ nhiễm bệnh rất cao ở bệnh nhân từ 70 tuổi trở lên (chiếm 29,3%).
- Đa số các chủng P. aeruginosađược phân lập từ bệnh phẩm đàm chiếm 60,3%.
