5. Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài
1.3.5. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn
1.3.5.1. Cơ chế đề kháng kháng sinh
Vi khuẩn có nhiều cơ chế đề kháng kháng sinh khác nhau và được chia thành 6 cơ chế sau:
- Giảm tính thấm hoặc hấp thụ của thuốc - Thải trừ tích cực ra ngoài tế bào (bơm đẩy).
- Sản xuất enzyme gây bất hoạt hoặc phân hủy thuốc.
Erythromycin gắn vào 50S rARN và ngăn cản sự chuyển vị trí trên mARN
Tetracycline ngăn cản tARN không đọc được mã trên
mARN
Chloramphenicol gắn vào 50S rARN và ức chế tạo cầu
peptide
Hình 1.8. Sự ức chế tổng hợp protein ở tế bào vi khuẩn của kháng sinh [68]
Streptomycin thay đổi hình dạng của 30S rARN và dẫn
30
- Thay đổi con đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc. - Thay đổi mục tiêu tác động của kháng sinh.
- Mất enzyme tham gia vào kích hoạt thuốc.
Hình 1.9. Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn [69]
a. Giảm tính thấm hoặc hấp thụ thuốc của màng
Các chất kháng sinh cần phải xâm nhập vào bên trong tế bào vi khuẩn để tác động lên vị trí mục tiêu. Kênh porin là con đường mà hầu hết các kháng sinh thông
Giảm tính thấm của màng
Bơm đẩy tích cực
Sản xuất enzyme làm biến đổi kháng sinh
Sản xuất enzyme phân hủy kháng
sinh Sản xuất dư thừa
mục tiêu tác động Thay đổi con đường chuyển hóa
31
thường sử dụng để vượt qua hệ thống màng ngoài của vi khuẩn. Một số vi khuẩn có thể tự bảo vệ mình bằng cách đóng hoặc thay đổi kênh porin để ngăn cản kháng sinh xâm nhập vào bên trong tế bào. Đa số các vi khuẩn Gram âm đều làm giảm sự hấp thụ của một số kháng sinh nhất định. Cơ chế này được phát hiện thấy ở: P. aeruginosa, Enterobacter aerogenes và Klebsiella spp kháng với Imipenem (kháng sinh thuộc nhóm β-lactams), nhiều vi khuẩn Gram âm kháng với Aminoglycosides, Quinolones, Sulfamethoxazole và Trimethoprim.
b. Thải trừ tích cực ra ngoài
Để có tác động hiệu quả lên tế bào vi khuẩn, kháng sinh phải có một nồng độ cao tại vị trí tác động bên trong tế bào vi khuẩn. Một số vi khuẩn có protein màng đóng vai trò như một máy bơm đẩy các kháng sinh ngược ra bên ngoài tế bào, điều này dẫn đến nồng độ kháng sinh nội bào thấp không đủ để tạo ra một hiệu lực để tác động lên tế bào vi khuẩn.
Cơ chế này đã được phát hiện ở:
E.colivà Enterobacteriaceae kháng đối với Tetracycline
Enterobacteriaceae kháng với Chloramphenicol
Staphylococci kháng với Macrolide và Streptogramin
Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumoniae kháng với Fluoroquinolones.
32
Vi khuẩn sản xuất enzyme có thể thay đổi hoặc làm giảm tác dụng hoặc phân hủy kháng sinh, bằng cách này chúng có thể phá hủy hoạt tính của kháng sinh. Cơ chế này được biết đến nhiều nhất và sớm nhất với penicillinase phá hủy vòng β- lactams biến Penicillin thành penicilloic acid, làm mất tác dụng của thuốc. Chloramphenicol được biết đến với sự bất hoạt kháng sinh bởi enzyme acetyltransferase acetyl hóa 2 nhóm hydroxyl của Chloramphenicol. Các vi khuẩn Gram âm như: Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa có khả năng sản xuất enzyme carbapenemse có khả năng thủy phân kháng sinh thuộc nhóm Carbapenem.
d. Thay đổi con đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc
Đột biến trong ADN của vi khuẩn thay đổi enzyme mục tiêu trong con đường trao đổi chất để bỏ qua các mục tiêu chính (Ví dụ: Trimethoprim).
e. Thay đổi mục tiêu tác động
Mỗi chất kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác nhau ở vi khuẩn, các đích cho kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào hoặc không thể tác động đến vi khuẩn. Cơ chế đề kháng này xảy ra hầu hết với tất cả các kháng sinh.
Staphylococcus aureus đề kháng với Methicillin và các kháng sinh thuộc nhóm β-lactams: kháng sinh nhóm β-lactams tác động đến vi khuẩn bằng cách gắn vào cấu trúc penicillin binding protein (PBP) trên thành tế bào vi khuẩn và ức chế tổng hợp thành tế bào. Staphylococcus aureus đã sản xuất một PBP bị biến đổi (PBP2a) làm kháng sinh không thể liên kết và không thể ức chế tổng hợp thành tế bào.
33
Mycobacterium spp. kháng với Streptomycin (sửa đổi ribosome protein hoặc 16s rARN).
Đột biến trong ARN polymerase dẫn đến sức tăng đề kháng cho Rifamycins. Đột biến trong ADN gyrase dẫn đến kháng Quinolone.
g. Mất enzyme tham gia vào kích hoạt thuốc
Mất enzyme tham gia vào việc kích hoạt thuốc là một cơ chế kháng kháng sinh tương đối mới. Trong trường hợp này kháng sinh được xem là một tiền chất không thể tác động trực tiếp lên tế bào vi khuẩn và sự hoạt động của kháng sinh phụ thuộc vào sự kích hoạt của một enzyme do tế bào vi khuẩn sản xuất. Khi các gen mã hóa cho các enzyme này bị đột biến thì kháng sinh khi đó sẽ không được chuyển hóa và không thể tác động lên tế bào vi khuẩn [64].
Ví dụ: Isoniazid (INH) là một trong những kháng sinh được dùng trong điều trị bệnh lao, catalase-peroxidase (KatG) là một hemoprotein nhị chức được chứng minh là để kích hoạt Isoniazid, trong đó nó tham gia một loạt các phản ứng oxy hóa, cặp NAD+
/ NADH tạo thành sản phẩm phức Isoniazid-NADH có khả năng ức chế nhiều mục tiêu bao gồm cả tổng hợp acid mycolic. Một ví dụ khác là Metronidazole (MTZ) được kích hoạt thông qua nitroreductase (RdxA), và sau đó hình thành các chất phản ứng gây tổn hại ADN. Vì vậy, những đột biến trong enzyme này gây ra sự đề kháng với Metronidazole.
1.3.5.2. Gene đề kháng kháng sinh và cơ chế lan truyền gene đề kháng
Khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn xuất phát từ các gene kháng kháng sinh của vi khuẩn. Các gene kháng kháng sinh có thể do các đột biến xuất hiện ngẫu nhiên trong vật chất di truyền của vi khuẩn (trên NST hoặc Plasmid). Một vi khuẩn có gene đề kháng, nó sẽ truyền dọc sang các thế hệ sau qua sự nhân lên
34
của tế bào; ngoài ra thông qua các hình thức vận chuyển di truyền, gene đề kháng có thể được truyền ngang từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua các quá trình: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp.
Hiện nay đã phát hiện được rất nhiều các gene mã hoá cho khả năng đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn. Ví dụ:
Các gene liên quan đến cơ chế bơm đẩy: mefA/E kháng Macrolides, amrAB- OprA, mexXY-OprM và acrD kháng Aminoglycosides, mexAB-OprM kháng nhóm β-lactams.
Các enzym carbapenemase thuỷ phân enzym nhóm Carbapenem: blaVIM,
blaSIM, blaIPM, blaKPC, blaSPM, blaGIM…
Đặc biệt hiện đã xuất hiện vi khuẩn siêu kháng thuốc mang gene blaNDN-1 có khả năng kháng lại tất cả các kháng sinh
1.3.5.3. Cơ chế đề kháng kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa
Việc sử dụng rộng rãi các lại kháng sinh trong điều trị nhiễm trùng do P. aeruginosađã tạo ra áp lực chọn lọc dẫn đến P. aeruginosa đã trở nên đề kháng với hầu hết các kháng sinh được dùng để điều trị hiện nay. Cũng giống các vi khuẩn gây bệnh khác, sự đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa gồm các cơ chế sau:
- Giảm tính thấm hoặc hấp thụ của thuốc của màng - Thải trừ tích cực ra ngoài bằng hệ thống bơm đẩy - Sản xuất enzyme gây bất hoạt hoặc phân hủy thuốc - Thay đổi mục tiêu tác động của thuốc
35
a. Giảm tính thấm hoặc hấp thụ của thuốc của màng
Màng ngoài của P.aeruginosa như một rào cản đối với sự xâm nhập của thuốc kháng sinh, hạn chế tốc độ xâm nhập của các phân tử nhỏ ưa nước. Các kháng sinh có kích thước nhỏ, ưa nước như β-Lactam và Quinolone chỉ có thể xâm nhập vào bên trong tế bào thông qua các kênh porin protein. P. aeruginosa sản xuất các loại porin khác nhau, oprF là loại lớn hiện diện trong tất cả các chủng. Mặc dù có đột biến thiếu oprF được báo cáo, mất oprF chưa được chứng minh là một nguyên nhân chính gây kháng kháng sinh. OprD là một porin chuyên biệt có vai trò trong sự hấp thu các axit amin mang điện tích dương như lysine. Mất oprD thường kết hợp với kháng với Imipenem. Tuy nhiên, Meropenem lại không bị ảnh hưởng bởi mất oprD. Điều này chỉ ra rằng Carbapenems đã vượt qua màng ngoài bởi các kênh khác nhau. Các kháng sinh nhóm Aminoglycosides và Colistin không vượt qua màng ngoài thông qua các kênh porin. Thay vào đó chúng thúc đẩy sự hấp thu bằng cách gắn vào các lipopolysaccharide (LPS) trên mặt ngoài của màng tế bào. Điều này phá hủy rào cản tính thấm của màng ngoài và cho phép thuốc kháng sinh để xâm nhập qua bức tường màng tế bào chất [40], [57].
b. Thải trừ tích cực ra ngoài bằng hệ thống bơm đẩy
Hệ thống bơm được cấu tạo gồm 3 phân tử protein màng, sự sắp xếp của 3 phân tử protein này tạo thành một hệ thống phun hiệu quả các phân tử độc hại bên trong tế bào chất ra bên ngoài. Bốn hệ thống bơm đẩy kháng sinh khác nhau được mô tả trong P. aeruginosa là: mexAB-oprM, mexXY-oprM, mexCD-oprJand, mexEF-oprN10. Các gen mã hóa ra hệ thống bơm đẩy này đã được xác định vị trí trên plasmid của P.aeruginosa.Tất cả các lớp thuốc kháng sinh, ngoại trừ Polymyxins dễ bị đào thải bởi một hoặc nhiều các hệ thống bơm đẩy này. MexAB- oprM chịu trách nhiệm loại bỏ β-Lactams, Quinolone và một loạt các chất khử
36
trùng. MexXY-oprM loại bỏ Aminoglycosides và mexEF-oprN loại bỏ Carbapenem và Quinolone [40], [57].
c. Sản xuất enzyme gây bất hoạt hoặc phân hủy thuốc
Tất cả các chủng P. aeruginosa đều có gene ampC kháng β-Lactams. Các β- lactamase sản xuất bởi P. aeruginosa bao gồm phổ rộng các enzyem được mã hóa bởi các gene nằm trên plasmid hoạt động chống lại các Penicillin và Cephalosporin. Đặc biệt các enzyme carbapenemase được dự báo sẽ đe dọa sự kháng kháng sinh trong tương lai, cụ thể nhóm vi khuẩn P. aeruginosa có thể sản xuất loại carbapenemase là metallo- β – lactamase (MBL) được mã hóa bởi các gen blaVIM,
blaIPM, blaGIM, blaSIM có khả năng thủy phân các kháng sinh nhóm Carbapenem, một trong những vũ khí hữu hiệu cuối cùng để điều trị P. aeruginosa [57].
d. Thay đổi mục tiêu tác động của thuốc
Cơ chế này là kết quả của đột biến làm thay đổi enzyme mục tiêu, là sản phẩm quan trọng trong quá trình chuyển hóa diễn ra bên trong tế bào, tạo ra sức đề kháng đối với hoạt động ức chế chọn lọc của kháng sinh. Trong cơ chế kháng thuốc của P. aeruginosa thường gặp nhất là với các Quinolone thông qua đột biến ở gene mã hóa các gyrA, một tiểu đơn vị của enzyme mục tiêu, ADN gyrase. Những thay đổi trong cấu trúc của tiểu đơn vị ribosome 30S (mục tiêu aminoglycoside) ảnh hưởng đến tính nhạy cảm của Streptomycin. Thay đổi trong protein gắn Penicilin của P. aeruginosa dẫn đến tăng sức đề kháng với β-Lactams [57].
e. Màng sinh học và khả năng kháng kháng sinh
Đây là một cơ chế kháng đặc biệt của P. aeruginosa, nhất là trong nhiễm trùng phổi. Màng sinh học là một cấu trúc có tổ chức thành phần chính là polysaccharide, màng gồm tập hợp các tế bào vi khuẩn sống và bám vào bề mặt, là
37
nơi các vi khuẩn trao đổi thông tin di truyền và trao đổi chất cho nhau cùng như chống lại kẻ thù và các hóa chất nguy hiểm. Các màng sinh học được cho là bất khả xâm phạm ngay cả khi bệnh nhân dùng kháng sinh với liều mạnh nhất. Trong nhiễm trùng phổi, P. aeruginosa phát triển tạo thành một tập hợp các tế bào được bao bọc và bảo vệ bởi lớp polysaccharide tạo thành lớp màng sinh học [57].