Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C- NMR (125 MHz) được đo trờn mỏy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn độ nội là tetramethylsiane của Viện Húa học, Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.3.4. Độ quay cực []D
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 30
2.4. Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tỏch chiết
Cỏc dụng cụ và thiết bị dựng cho tỏch chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
- Bỡnh chiết 30 lớt - Bếp điện
- Đốn tử ngoại hai bước súng 254 và 368 nm - Bỡnh sắc ký loại phõn tớch và điều chế - Cột sắc ký pha thường cỏc loại đường kớnh - Cột sắc ký pha ngược trung ỏp
- Mỏy cụ quay chõn khụng - Mỏy phun dung dịch thuốc thử - Mỏy sấy
- Micropipet
- Tủ sấy chõn khụng
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xỏc định cấu trỳc
- Mỏy phổ cộng hưởng từ hạt nhõn NMR AM500 FT-NMR spectrometer. - Mỏy sắc ký lỏng cao ỏp ghộp nối khối phổ (ESI) AGILENT 1200 LC-MSD Trap spectrometer.
- Thiết bị đo độ quay cực JASCO P 20000.
-Thiết bị đo điểm núng chảy Kofler micro-hotstage.
2.5. Hoỏ chất.
- Bản mỏng trỏng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715). - Bản mỏng trỏng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck).
- Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
- Cỏc loại dung mụi hữu cơ như methanol, etanol, ethyl acetate, chloroform, hexane, acetone, v.v... là loại hoỏ chất tinh khiết của Merck.
- Silica gel 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 31 xay nhỏ thành bột thu được 2 kg bột khụ.
Phần bột khụ được ngõm chiết với metanol (5 L x 3 lần) trong bể siờu õm ở nhiệt độ 40-50oC, mỗi lần 60 phỳt. Phần dịch chiết được cất loại dung mụi dưới ỏp suất giảm thu được dịch cao chiết metanol 160 g. Cao chiết được hoà với nước (1 lớt) rồi chiết phõn đoạn lần lượt với n-hexan (1L x 3) và clofoc (1L x 3) thu được cỏc cắn chiết n-hexan (60 g), cắn clofoc (10 g) và cắn nước tương ứng. Phần dịch nước được lọc qua cột dianion và rửa giải lần lượt bằng nước, metanol:nước 50% và 100% metanol thu được phõn đoạn A1-A3. Tiến hành sắc ký cột với silicagel đối với phõn đoạn A3 rửa giải bằng hệ dung mụi gradient clofoc:metanol (100:1 v/v → 100% metanol) thu được 5 phõn đoạn ký hiệu B1- B5.Tinh chế phõn đoạn B3 lần lượt qua cỏc cột YMC-RP18 (metanol:nước 1:3 v/v) và qua cột silica gel với dung mụi rửa giải clofoc:metanol:nước 5:1:0.1 (v/v) thu được hợp chất 1 (10 mg). Tinh chế B2 qua cột YMC- RP18 với hệ dung mụi rửa giải metanol:nước 1:3 v/v thu được hai phõn đoạn C11 và C12. Tinh chế lại C12 trờn cột silica gel sử dụng dung mụi rửa giải n-hexan:clofoc:metanol 10.5:1:1 (v/v/v) thu được hợp chất 2 (15 mg).
3.2. Hằng số vật lý và cỏc dữ kiện phụ̉ của cỏc hợp chất
3.2.1. Hợp chất 1
Cỏc thụng số vật lý của hợp chất (1),cỏc số liệu như sau: - Chất bột màu vàng
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 32 - Phổ khối lượng ESI-MS (negative) m/z:446,8 [M-H]-
- Tờn khoa học: 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside (1)
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) (ppm): 7,37 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6′), 7.36 (1H, br s, H-2′), 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′), 6.53 (1H, s, H-8), 6.47 (1H, s, H-3), 4.90 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.20 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-2′′), 3.91 (1H, dd, J = 1.5, 12.0 Hz, H-6′′b), 3.76 (1H, dd, J = 5.5, 12.0 Hz, H-6′′a), 3.50 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-3′′), 3.49 (1H, m, H-4′′), 3.45 (1H, m, H-5′′). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm): 166,2 (C-2), 103,8 (C-3), 183,9 (C-4), 162,0 (C-5), 109,1 (C-6), 165,1 (C-7), 95,2 (C-8), 158,7 (C-9), 105,1 (C-10), 123,5 (C-1′), 114,1 (C-2′),147,0 (C-3′), 151,0 (C-4′),116,7 (C- 5′), 120,3 (C-6′), 75,3 (C-1′′), 71,7 (C-2′′), 80,1 (C-3′′), 72,6 (C-4′′), 82,6 (C- 5′′) và 62,8 (C-6′′). 3.2.2. Hợp chất 2
Cỏc thụng số vật lý của hợp chất (2), cỏc số liệu như sau: - Chất bột màu vàng
- Điểm núng chảy mp: 240-242oC
- Phổ khối lượng ESI-MS (positive) m/z: 454,9 [M+Na]+
- Tờn khoa học: 4',5,7-trihydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside (2)
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 7.78 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.44 (1H, s, H-3), 6.33 (1H, s, H-8), 4.90 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.33 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-2′′), 3.87 (1H, dd, J
= 1.5, 12.0 Hz, H-6′′b), 3.80 (1H, dd, J = 5.5, 12.0 Hz, H-6′′a), 3.57 (1H, m, H-4′′), 3.48 (1H, t, J = 9.0 Hz, H-3′′), 3.44 (1H, m, H-5′′).
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 33 5′′) và 62,5 (C-6′′).
3.3. Đỏnh giỏ tỏc dụng quột gốc tự do DPPH
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) cú khả năng tạo ra cỏc gốc tự do bền trong dung dịch MeOH. Cỏc chất cú khả năng làm trung hoà hoặc bao võy cỏc gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ỏnh sỏng của cỏc gốc tự do DPPH. Hoạt tớnh chống oxy hoỏ được đỏnh giỏ thụng qua giỏ trị hấp phụ ỏnh sỏng của dịch thớ nghiệm so với đối chứng khi đo ở bước súng 517nm [15]. Theo đú, 10 àl mẫu pha trong DMSO (dimethyl sulfoxid) được cho vào cỏc giếng của phiến 96 giếng chứa 190 àl dung dịch 150 àM DPPH/MeOH. Sau 30 phỳt ủ trong búng tối ở nhiệt độ phũng, độ hấp thụ của cỏc dung dịch phản ứng được đo trờn mỏy ELISA ở bước súng 517nm. Kết quả được biểu thị bằng giỏ trị scavenging capactity (SC50). Hoạt chất catechin được sử dụng làm đối chứng dương.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 34
CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Xỏc định cấu trỳc húa học của hợp chất 1.
Hợp chất 1 thu được dưới dạng chất bột màu vàng, phổ khối lượng phun mự điện tử cú pớc ion giả phõn tử [M-H]- tại m/z 446,8 chứng tỏ 1 cú khối lượng phõn tử 448. Trờn phổ 1H-NMR (hỡnh 4.1.2) của 1, tại vựng
trường thấp cú 5 tớn hiệu của olefin vũng thơm gồm cú hai proton dạng singlet tại 6.47 (1H, s, H-3), 6.53 (1H, s, H-8), một hệ vũng thơm kiểu ABX tại H 7.36 (1H, br s, H-2'), 7.37 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6'), và 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5'). Ngoài ratại vựng trường trung bỡnh 3.44-4.90 cũn cú cỏc tớn hiệu proton của một nhúm đường.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 35 cho một đơn vị đường C-glucospyranosit [17]. Cũn lại 15 vạch tớn hiệu phự hợp với cấu trỳc của một flavonoit cú vũng B thế 1,3,5. So sỏnh cỏc dữ kiện phổ trờn với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất 1 là 3',4',5,7- tetrahydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside [16].
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 36
Hỡnh 4.1.3. Phụ̉ 13C-NMR của hợp chất 1
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 37
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 38
Bảng 1. Số liệu phụ̉ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 1, hợp chất 2 phõn lập từ lỏ Kim tiền thảo
1 2 C H ppm (J, Hz) C ppm H ppm (J, Hz) C ppm 2 - 166.2 - 165.42 3 6.47 s 103.8 6.44 s 103.02 4 - 183.9 - 183.1 5 - 162.0 - 161.9 6 - 109.1 - 110.2 7 - 165.1 - 165.4 8 6.53 s 95.2 6.33 s 96.9 9 - 158.7 - 159.2 10 - 105.1 - 103.8 1′ - 123.5 - 122.8 2′ 7.36 s 114.1 7.78 (d, J = 8.5) 129.1 3′ - 147.0 6.90 (d, J = 8.5) 117.2 4′ - 151.0 - 163.5 5′ 6.90 (d, 8.5) 116.7 6.90 (d, J = 8.5) 117.1 6′ 7.37 (d, 8.5) 120.3 7.78 (d, J = 8.5) 129.1 1′′ 4.90 (d, J = 7.5) 75.3 4.90 (d, J = 7.5) 75.6 2′′ 4.20 (t, J = 8.5) 71.7 4.33 (t, J = 8.5) 72.3 3′′ 3.50 (t, J = 8.5) 80.1 3.48 (t, J = 9.0) 80.5 4′′ 3.49 m 72.6 3.57 m 71.5 5′′ 3.45 m 82.6 3.44 m 82.3 6′′ 3.76 (dd, J = 5.5, 12.0, H-6a′′) 62.8 3.80 (dd, J = 5.5, 12.0, H-6a′′) 62.5 3.91 (dd, J = 1.5, 12.0, H-6b′′) 3.86 (dd, J = 1.5, 12.0, H-6b′′)
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 39
Hỡnh 4.2.1. Phụ̉ ESI-MS của hợp chất 2
Cỏc phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 2 tương tự như cỏc phổ tương ứng của 1 cho phộp xỏc định hai hợp chất cú cấu trỳc tương tự nhau (Bảng 1). Sự khỏc biệt dễ nhận thấy nhất nằm ở cỏc tớn hiệu của vũng B với sự xuất hiện tớn hiệu của hai cặp proton hệ A2B2, cú tương tỏc vị trớ ortho với nhau tại δC 129.1 (C-2', 6')/δH 7.78 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2, 6) và δC 117.2 (C-3', 5')/δH 6.90 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3', 5'). Số liệu này cho phộp xỏc định hợp chất 2 là
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 40
Hỡnh 4.2.2. Phụ̉ 1H-NMR của hợp chất 2
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 41
Hỡnh 4.2.4. Phụ̉ DEPT của hợp chất 2
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 42
4.3 Kết quả đỏnh giỏ hoạt tớnh quột gốc tự do DPPH
Kết quả thử nghiệm hoạt tớnh chống oxi húa của cỏc hợp chất phõn lập được cho thấy hợp chất 1 cú khả năng quột gốc tự do DPPH tương đối mạnh cũn 2 khụng cú tỏc dụng. Giỏ trị SC50 của hợp chất 1 là 3,71 àg/ml thấp hơn nhiều so với đối chứng dương catechin là 15,13 àg/ml (Hỡnh 4.3). Đỏng chỳ ý hợp chất 1 cú số nhúm hydroxy ở vũng B nhiều hơn so với 2 và thể hiện hoạt tớnh mạnh hơn. Điều này phự hợp với cỏc nghiờn cứu trước đõy đó chứng minh sự cú mặt của nhúm hydroxy ở vũng B cú vai trũ quan trọng trong khả năng chống oxy húa [18].
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 3 10 15 % sca ve ng in g act iv ity
Hợp chất 1 (ug/ml) (+)-Catechin (ug/ml)
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 43 đảo, sắc ký lớp mỏng điều chế, em đó phõn lập được 2 hợp chất flavonoit sau:
1. Hợp chất 1: 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside
2. Hợp chất 2: 4',5,7-trihydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside từ lỏ cõy Kim tiền thảo
Cấu trỳc của cỏc hợp chất này được xỏc định bằng cỏc phương phỏp phổ hiện đại bao gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhõn một chiều (1H-NMR, 13C- NMR, DEPT 135, DEPT 90) và phổ khối lượng.
Cỏc kết quả nghiờn cứu trờn đõy bước đầu đó đúng gúp thờm vào việc làm sỏng tỏ thành phần hoỏ học của cõy cõy Kim tiền thảo.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 44
TÀI LIậ́U THAM KHẢO
[1] Đỗ Tất Lợi. Những cõy thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB y học, Hà Nội, trang 267-268(2000).
[2] Vừ Văn Chi. Từ điển cõy thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội, trang 1322(1999).
[3] M. Xhao, J.A. Duan, C.T. Che. Phytochem. 68, 1471-1479 (2007).
[4] X. Ma, C. Zheng, C. Hu, K. Rahman, L. Qin. J. Ethnopharmacol. 138, 314-332 (2011).
[5] S. Rastogi, M.M. Pandey, A. Kumar, S. Rawat. J. Ethnopharmacol. 136, 183-296 (2011).
[6] A. Rathi, C.V. Rao, B. Ravishankar, S. De, S. Mehrotra. J. Ethnopharmacol. 95, 259-263 (2004).
[7] S. Dudonne, X. Vitrac, P. Coutiere, M. Woillez, J.M. Merillon. J. Agric. Food Chem. 57, 1768-1774 (2009).
[8] Hayerman A.E., Butler I.G., Assay of condensed tanin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant, Meth, Enz, 234, pp 249 (1994).
[9] Ternai B., Markham K.R., C13-NMR of flavonoids-1-Flavones and flavonols, Tetrehedron 32, pp 565 (1976).
[10] Mabry F.J., Markman R.B., Thomas M.B., The syrematic indentification of flavonoids, springer Verlag-Berlin-Heidelberg-New york, (1970).
[11] Harborn J.B., The flavonoids advance in research since 1986, Chaprman & Hall, (1994).
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 45
triterpenes from the fruits of Rosa sterilis, Journal of Natural Products, Vol.52, pp 162-167 (1989).
[15] S. Dudonne, X. Vitrac, P. Coutiere, M. Woillez, J.M. Merillon. J. Agric. Food Chem. 57, 1768-1774 (2009).
[16] S. Rayyan, T. Fossen, S.H. Nateland, O.M. Andersen. Phytochem. Anal. 16, 334-341 (2005).
[17] N. Ramarathnam, T. Osawa, M. Namiki, S. Kawakishi. J. Agric. Food Chem. 37, 316-319 (1989).
[18] J.C. Luis, F. Valdes, R. Martin, A.J. Carmona, J.G. Diaz.DPPH radical scavenging activity of two flavonol glycosides from Aconitum napellus sp. lusitanicum. Fitoterapia 77, 469-471 (2006).