Đặc trưng của Húa hữu cơ ngày nay là việc ứng dụng rộng rói cỏc phương phỏp phổ trong nghiờn cứu cấu trỳc, cơ chế phản ứng và tớnh chất của cỏc hợp chất hữu cơ. Chẳng hạn trong việc xỏc định cấu trỳc phõn tử, cỏc phương phỏp phổ hầu như đó thay thế hoàn toàn cỏc phương phỏp húa học. Tuỳ thuộc vào cấu trỳc hoỏ học của từng chất mà người ta sử dụng phương phỏp phổ cụ thể. Cấu trỳc càng phức tạp thỡ yờu cầu phối hợp cỏc phương
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 23 Cỏc hợp chất hữu cơ hấp phụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vựng 10 000 – 100 000cm-1 và biến thành năng lượng dao động của phõn tử. Phổ hồng ngoại được xõy dựng trờn sự khỏc nhau của cỏc dao động của cỏc liờn kết trong phõn tử hợp chất dưới sự kớch thớch của cỏc tia hồng ngoại. Như vậy phổ hồng ngoại là phổ hấp phụ của năng lương quay và năng lượng dao động.
Tần số hay độ dài súng hấp phụ trong mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng tương đối của cỏc nguyờn tử, cấu trỳc hỡnh học và liờn kết của chỳng. Mỗi hợp chất khỏc nhau chứa cỏc liờn kết khỏc nhau thỡ sự hấp phụ hồng ngoại là khỏc nhau. Dựa và phổ hồng ngoại , cú thể xỏc định được cỏc nhúm chức dặc trưng trong hợp chất hữu cơ.
Phổ hồng ngoại được chia thành 3 vựng: vựng súng ngắn từ 4000 – 1300 cm-1, vựng súng trung bỡnh từ 1300 – 909 cm-1 và vựng súng dài từ 909 – 650 cm-1.
Vựng súng ngắn cỏc nhúm chức hữu cơ bị hấp phụ là OH, NH, CO… Nếu khụng cú dải hấp phụ trong vựng 1850 – 1540 cm-1 là khụng cú nhúm CO, khụng cú dải hấp phụ ở 3650 – 3200 cm-1 là khụng cú nhúm OH phenol hoặc ancol. Cỏc hợp chất thơm hoặc tạp thơm thường cú dải hấp phụ nằm trong khoảng 1600 – 1300 cm-1.
Vựng súng trung bỡnh được gọi là vựng chỉ võn tay vỡ nú được dựng để nhận dạng cỏc hợp chất hữu cơ theo phương phỏp so sỏnh trực tiếp..
Vựng súng dài đặc trưng cho cỏc hấp phụ của dao động biến dạng. Nếu khụng cú dải hấp phụ trong khoảng 909 – 605 cm-1 là hợp chất khụng cú cấu
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 24 trỳc thơm. Cỏc hấp phụ của dao động biến dạng của vũng thơm, biến dạng C- H ngoài mặt phẳng của cỏc hợp chất thơm và tạp thơm xuất hiện với cường độ mạnh và thường cú liờn quan đến nhúm thế của cỏc hợp chất. Nếu cú dải hấp thụ rộng với cường độ mạnh thỡ rất cú thể cú mặt của cỏc dime của axit cacboxylic, của amit, amin. Nếu cú cỏc dải ở gần 1000cm-1 thỡ rất cú thể cú cấu trỳc olefin.
Phổ hồng ngoại IR được xõy dựng dựa vào sự khỏc nhau về dao động của cỏc liờn kết trong phõn tử hợp chất dưới sự kớch thớch của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liờn kết được đặc trưng bởi một vựng bước súng khỏc nhau. Do đú, dựa vào phổ hồng ngoại, cú thể xỏc định được cỏc nhúm chức đặc trưng trong hợp chất, vớ dụ như dao động hoỏ trị của nhúm OH tự do trong cỏc nhúm hydroxyl là 3300- 3450 cm-1, của nhúm cacbonyl C = O trong khoảng 1700- 1750 cm-1…
1.5.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS).
Phổ khối lượng được sử dụng khỏ phổ biến để xỏc định cấu trỳc húa học của cỏc hợp chất hữu cơ. Nguyờn tắc của phương phỏp phổ này là dựa vào sự phõn mảnh ion của phõn tử chất dưới sự bắn phỏ của chựm ion bờn ngoài. Phổ MS cũn cho cỏc pic ion mảnh khỏc mà dựa vào đú người ta cú thể xỏc định được cơ chế phõn mảnh và dựng lại được cấu trỳc hoỏ học cỏc hợp chất. Hiện nay cú rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương phỏp chủ yếu sau:
- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phõn mảnh ion dưới tỏc dụng của chựm ion bắn phỏ năng lượng khỏc nhau, phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mự điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phỏ thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đú phổ thu được chủ yếu là pic ion phõn tử
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 25 phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phõn tử.
- Phổ khối lượng phõn giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phộp xỏc định pic ion phõn tử hoặc ion mảnh với độ chớnh xỏc cao. Kết quả phổ khối lượng phõn giải cao cựng với kết quả phõn tớch nguyờn tố sẽ cho phộp khẳng định chớnh xỏc cụng thức cộng của cỏc hợp chất hữu cơ.
- Ngoài ra, hiện nay người ta cũn sử dụng kết hợp cỏc phương phỏp sắc ký kết hợp với khối phổ khỏc như: GC-MS (sắc ký khớ-khối phổ), LC-MS (sắc ký lỏng-khối phổ). Cỏc phương phỏp kết hợp này cũn đặc biệt hữu hiệu khi phõn tớch thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phõn tớch thuốc trong ngành dược).
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy). Spectroscopy).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn là một phương phỏp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp cỏc kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, cỏc nhà nghiờn cứu cú thể xỏc định chớnh xỏc cấu trỳc của hợp chất, kể cả cấu trỳc lập thể của phõn tử.
Nguyờn lý chung của cỏc phương phỏp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự khỏc nhau của cỏc hạt nhõn từ (1H và 13C) dưới tỏc dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khỏc nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hoỏ học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phõn tử cũn được xỏc định dựa vào tương tỏc spin giữa cỏc hạt nhõn từ với nhau (spin coupling).
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 26
1.5.3.1. Phổ 1H-NMR:
Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hoỏ học của cỏc proton được xỏc định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoỏ của nguyờn tử cũng như đặc trưng riờng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hoỏ học và tương tỏc spin mà ta cú thể xỏc định được cấu trỳc hoỏ học của cỏc hợp chất.
1.5.3.2. Phổ 13C-NMR:
Phổ này cho tớn hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyờn tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khỏc nhau và cho tớn hiệu phổ khỏc nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0 - 230ppm.
1.5.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer):
Phổ này cho ta cỏc tớn hiệu phõn loại cỏc loại cacbon khỏc nhau. Trờn phổ DEPT, tớn hiệu của cỏc cacbon bậc bốn biến mất. Tớn hiệu của CH và CH3 nằm về một phớa và của CH2 về một phớa trờn phổ DEPT 1350. Trờn phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tớn hiệu phổ của cỏc CH.
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR:
Đõy là cỏc kỹ thuật phổ hai chiều, cho phộp xỏc định cỏc tương tỏc của cỏc hạt nhõn từ của phõn tử trong khụng gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Cỏc tương tỏc trực tiếp H-C được xỏc định nhờ vào cỏc tương tỏc trờn phổ này. Trờn phổ, một trục là phổ 1H-NMR, cũn trục kia là 13C-NMR. Cỏc tương tỏc HMQC nằm trờn đỉnh cỏc ụ vuụng trờn phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn cỏc tương tỏc xa của H-H, chủ yếu là cỏc proton đớnh với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà cỏc phần của phõn tử được nối ghộp lại với nhau.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 27 - Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn cỏc tương tỏc xa trong khụng gian của cỏc proton khụng kể đến cỏc liờn kết mà chỉ tớnh đến khoảng cỏch nhất định trong khụng gian. Dựa vào kết quả phổ này cú thể xỏc định cấu trỳc khụng gian của phõn tử.
Người ta cũn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để xỏc định cấu trỳc khụng gian của phõn tử. Bằng việc đưa vào một xung đỳng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xỏc định thỡ cỏc proton cú cựng phớa về khụng gian cũng như gần nhau về khụng gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tớn hiệu với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra, cũn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xỏc định cấu trỳc khụng gian của toàn bộ phõn tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng phạm vi sử dụng của nú hạn chế vỡ yờu cầu cần tiờn quyết của phương phỏp này là cần phải cú đơn tinh thể. Đõy là một điều kiện khụng phổ biến đối với cỏc hợp chất hữu cơ.
Như trờn đó đề cập, ngoài việc sử dụng cỏc loại phổ, người cũn sử dụng kết hợp với cỏc chuyển hoỏ hoỏ học cũng như cỏc phương phỏp phõn tớch, so sỏnh kết hợp khỏc. Đặc biệt đối với cỏc phõn tử nhiều mạch nhỏnh dài, tớn hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khú xỏc định chớnh xỏc được chiều dài cỏc mạch. Đối với phõn tử cú cỏc đơn vị đường thỡ việc xỏc định chớnh xỏc loại đường cũng như cấu hỡnh đường thụng thường phải sử dụng phương phỏp thuỷ phõn rồi xỏc định bằng phương phỏp so sỏnh LC-MS hoặc GC-MS với cỏc đường chuẩn dự kiến.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 28
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Mẫu thực vật.
Mẫu cõy Kim tiền thảo thu hỏi ở Tam đảo, Vĩnh phỳc vào thỏng 6/2012 và được PGS.TS. Trần Huy Thỏi, Viện Sinh Thỏi tài nguyờn Sinh vật giỏm định tờn khao học. Mẫu tiờu bản được lưu giữ tại phũng Hoạt chất sinh học, Viện Húa sinh biển.
Hỡnh 2.1. Ảnh chụp tiờu bản mẫu Kim tiền thảo
2.2. Phương phỏp phõn lập cỏc hợp chất.
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trờn bản mỏng trỏng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phỏt hiện chất bằng đốn tử ngoại ở hai bước súng 254 nm và 368 nm hoặc dựng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lờn bản mỏng, sấy khụ rồi hơ núng trờn bếp điện đến khi hiện màu.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 29 cũ để xỏc định vựng chất, tiếp theo cạo lớp Silicagel cú chất, giải hấp phụ bằng dung mụi thớch hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường cú cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).
2.3. Phương phỏp xỏc định cấu trỳc hoỏ học cỏc hợp chất.
2.3.1. Điểm núng chảy (Mp)
Điểm núng chảy được đo điểm núng chảy Mel – Temp 3.0 (Thermo Scientific).
2.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS)
Phổ khối lượng phun mự điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra) được đo trờn mỏy AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap của Viện Hoỏ học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C- NMR (125 MHz) được đo trờn mỏy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn độ nội là tetramethylsiane của Viện Húa học, Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.3.4. Độ quay cực []D
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 30
2.4. Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tỏch chiết
Cỏc dụng cụ và thiết bị dựng cho tỏch chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
- Bỡnh chiết 30 lớt - Bếp điện
- Đốn tử ngoại hai bước súng 254 và 368 nm - Bỡnh sắc ký loại phõn tớch và điều chế - Cột sắc ký pha thường cỏc loại đường kớnh - Cột sắc ký pha ngược trung ỏp
- Mỏy cụ quay chõn khụng - Mỏy phun dung dịch thuốc thử - Mỏy sấy
- Micropipet
- Tủ sấy chõn khụng
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xỏc định cấu trỳc
- Mỏy phổ cộng hưởng từ hạt nhõn NMR AM500 FT-NMR spectrometer. - Mỏy sắc ký lỏng cao ỏp ghộp nối khối phổ (ESI) AGILENT 1200 LC-MSD Trap spectrometer.
- Thiết bị đo độ quay cực JASCO P 20000.
-Thiết bị đo điểm núng chảy Kofler micro-hotstage.
2.5. Hoỏ chất.
- Bản mỏng trỏng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715). - Bản mỏng trỏng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck).
- Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
- Cỏc loại dung mụi hữu cơ như methanol, etanol, ethyl acetate, chloroform, hexane, acetone, v.v... là loại hoỏ chất tinh khiết của Merck.
- Silica gel 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 31 xay nhỏ thành bột thu được 2 kg bột khụ.
Phần bột khụ được ngõm chiết với metanol (5 L x 3 lần) trong bể siờu õm ở nhiệt độ 40-50oC, mỗi lần 60 phỳt. Phần dịch chiết được cất loại dung mụi dưới ỏp suất giảm thu được dịch cao chiết metanol 160 g. Cao chiết được hoà với nước (1 lớt) rồi chiết phõn đoạn lần lượt với n-hexan (1L x 3) và clofoc (1L x 3) thu được cỏc cắn chiết n-hexan (60 g), cắn clofoc (10 g) và cắn nước tương ứng. Phần dịch nước được lọc qua cột dianion và rửa giải lần lượt bằng nước, metanol:nước 50% và 100% metanol thu được phõn đoạn A1-A3. Tiến hành sắc ký cột với silicagel đối với phõn đoạn A3 rửa giải bằng hệ dung mụi gradient clofoc:metanol (100:1 v/v → 100% metanol) thu được 5 phõn đoạn ký hiệu B1- B5.Tinh chế phõn đoạn B3 lần lượt qua cỏc cột YMC-RP18 (metanol:nước 1:3 v/v) và qua cột silica gel với dung mụi rửa giải clofoc:metanol:nước 5:1:0.1 (v/v) thu được hợp chất 1 (10 mg). Tinh chế B2 qua cột YMC- RP18 với hệ dung mụi rửa giải metanol:nước 1:3 v/v thu được hai phõn đoạn C11 và C12. Tinh chế lại C12 trờn cột silica gel sử dụng dung mụi rửa giải n-hexan:clofoc:metanol 10.5:1:1 (v/v/v) thu được hợp chất 2 (15 mg).
3.2. Hằng số vật lý và cỏc dữ kiện phụ̉ của cỏc hợp chất
3.2.1. Hợp chất 1
Cỏc thụng số vật lý của hợp chất (1),cỏc số liệu như sau: - Chất bột màu vàng
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 32 - Phổ khối lượng ESI-MS (negative) m/z:446,8 [M-H]-
- Tờn khoa học: 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside (1)
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) (ppm): 7,37 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6′), 7.36 (1H, br s, H-2′), 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′), 6.53 (1H, s, H-8), 6.47 (1H, s, H-3), 4.90 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.20 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-2′′), 3.91 (1H, dd, J = 1.5, 12.0 Hz, H-6′′b), 3.76 (1H, dd, J = 5.5, 12.0 Hz, H-6′′a), 3.50 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-3′′), 3.49 (1H, m, H-4′′), 3.45 (1H, m, H-5′′). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm): 166,2 (C-2), 103,8 (C-3), 183,9 (C-4), 162,0 (C-5), 109,1 (C-6), 165,1 (C-7), 95,2 (C-8), 158,7 (C-9), 105,1 (C-10), 123,5 (C-1′), 114,1 (C-2′),147,0 (C-3′), 151,0 (C-4′),116,7 (C- 5′), 120,3 (C-6′), 75,3 (C-1′′), 71,7 (C-2′′), 80,1 (C-3′′), 72,6 (C-4′′), 82,6 (C- 5′′) và 62,8 (C-6′′). 3.2.2. Hợp chất 2
Cỏc thụng số vật lý của hợp chất (2), cỏc số liệu như sau: - Chất bột màu vàng
- Điểm núng chảy mp: 240-242oC
- Phổ khối lượng ESI-MS (positive) m/z: 454,9 [M+Na]+
- Tờn khoa học: 4',5,7-trihydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside (2)
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 7.78 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.44 (1H, s, H-3), 6.33 (1H, s, H-8), 4.90 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.33 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-2′′), 3.87 (1H, dd, J
= 1.5, 12.0 Hz, H-6′′b), 3.80 (1H, dd, J = 5.5, 12.0 Hz, H-6′′a), 3.57 (1H, m, H-4′′), 3.48 (1H, t, J = 9.0 Hz, H-3′′), 3.44 (1H, m, H-5′′).
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 33 5′′) và 62,5 (C-6′′).
3.3. Đỏnh giỏ tỏc dụng quột gốc tự do DPPH
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) cú khả năng tạo ra cỏc gốc tự do bền trong dung dịch MeOH. Cỏc chất cú khả năng làm trung hoà hoặc bao võy cỏc gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ỏnh sỏng của cỏc gốc tự do DPPH. Hoạt tớnh chống oxy hoỏ được đỏnh giỏ thụng qua giỏ trị hấp phụ ỏnh sỏng của dịch thớ nghiệm so với đối chứng khi đo ở bước súng 517nm [15]. Theo đú, 10 àl mẫu pha trong DMSO (dimethyl sulfoxid) được cho vào cỏc