cho phộp xỏc định pic ion phõn tử hoặc ion mảnh với độ chớnh xỏc cao. Kết quả phổ khối lượng phõn giải cao cựng với kết quả phõn tớch nguyờn tố sẽ cho phộp khẳng định chớnh xỏc cụng thức cộng của cỏc hợp chất hữu cơ.
- Ngoài ra, hiện nay người ta cũn sử dụng kết hợp cỏc phương phỏp sắc ký kết hợp với khối phổ khỏc như: GC-MS (sắc ký khớ-khối phổ), LC-MS (sắc ký lỏng-khối phổ). Cỏc phương phỏp kết hợp này cũn đặc biệt hữu hiệu khi phõn tớch thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phõn tớch thuốc trong ngành dược).
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy). Spectroscopy).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn là một phương phỏp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp cỏc kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, cỏc nhà nghiờn cứu cú thể xỏc định chớnh xỏc cấu trỳc của hợp chất, kể cả cấu trỳc lập thể của phõn tử.
Nguyờn lý chung của cỏc phương phỏp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự khỏc nhau của cỏc hạt nhõn từ (1H và 13C) dưới tỏc dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khỏc nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hoỏ học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phõn tử cũn được xỏc định dựa vào tương tỏc spin giữa cỏc hạt nhõn từ với nhau (spin coupling).
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 26
1.5.3.1. Phổ 1H-NMR:
Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hoỏ học của cỏc proton được xỏc định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoỏ của nguyờn tử cũng như đặc trưng riờng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hoỏ học và tương tỏc spin mà ta cú thể xỏc định được cấu trỳc hoỏ học của cỏc hợp chất.
1.5.3.2. Phổ 13C-NMR:
Phổ này cho tớn hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyờn tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khỏc nhau và cho tớn hiệu phổ khỏc nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0 - 230ppm.
1.5.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer):
Phổ này cho ta cỏc tớn hiệu phõn loại cỏc loại cacbon khỏc nhau. Trờn phổ DEPT, tớn hiệu của cỏc cacbon bậc bốn biến mất. Tớn hiệu của CH và CH3 nằm về một phớa và của CH2 về một phớa trờn phổ DEPT 1350. Trờn phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tớn hiệu phổ của cỏc CH.
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR:
Đõy là cỏc kỹ thuật phổ hai chiều, cho phộp xỏc định cỏc tương tỏc của cỏc hạt nhõn từ của phõn tử trong khụng gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Cỏc tương tỏc trực tiếp H-C được xỏc định nhờ vào cỏc tương tỏc trờn phổ này. Trờn phổ, một trục là phổ 1H-NMR, cũn trục kia là 13C-NMR. Cỏc tương tỏc HMQC nằm trờn đỉnh cỏc ụ vuụng trờn phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn cỏc tương tỏc xa của H-H, chủ yếu là cỏc proton đớnh với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà cỏc phần của phõn tử được nối ghộp lại với nhau.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 27 - Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn cỏc tương tỏc xa trong khụng gian của cỏc proton khụng kể đến cỏc liờn kết mà chỉ tớnh đến khoảng cỏch nhất định trong khụng gian. Dựa vào kết quả phổ này cú thể xỏc định cấu trỳc khụng gian của phõn tử.
Người ta cũn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để xỏc định cấu trỳc khụng gian của phõn tử. Bằng việc đưa vào một xung đỳng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xỏc định thỡ cỏc proton cú cựng phớa về khụng gian cũng như gần nhau về khụng gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tớn hiệu với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra, cũn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xỏc định cấu trỳc khụng gian của toàn bộ phõn tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng phạm vi sử dụng của nú hạn chế vỡ yờu cầu cần tiờn quyết của phương phỏp này là cần phải cú đơn tinh thể. Đõy là một điều kiện khụng phổ biến đối với cỏc hợp chất hữu cơ.
Như trờn đó đề cập, ngoài việc sử dụng cỏc loại phổ, người cũn sử dụng kết hợp với cỏc chuyển hoỏ hoỏ học cũng như cỏc phương phỏp phõn tớch, so sỏnh kết hợp khỏc. Đặc biệt đối với cỏc phõn tử nhiều mạch nhỏnh dài, tớn hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khú xỏc định chớnh xỏc được chiều dài cỏc mạch. Đối với phõn tử cú cỏc đơn vị đường thỡ việc xỏc định chớnh xỏc loại đường cũng như cấu hỡnh đường thụng thường phải sử dụng phương phỏp thuỷ phõn rồi xỏc định bằng phương phỏp so sỏnh LC-MS hoặc GC-MS với cỏc đường chuẩn dự kiến.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 28
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Mẫu thực vật.
Mẫu cõy Kim tiền thảo thu hỏi ở Tam đảo, Vĩnh phỳc vào thỏng 6/2012 và được PGS.TS. Trần Huy Thỏi, Viện Sinh Thỏi tài nguyờn Sinh vật giỏm định tờn khao học. Mẫu tiờu bản được lưu giữ tại phũng Hoạt chất sinh học, Viện Húa sinh biển.
Hỡnh 2.1. Ảnh chụp tiờu bản mẫu Kim tiền thảo
2.2. Phương phỏp phõn lập cỏc hợp chất.
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trờn bản mỏng trỏng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phỏt hiện chất bằng đốn tử ngoại ở hai bước súng 254 nm và 368 nm hoặc dựng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lờn bản mỏng, sấy khụ rồi hơ núng trờn bếp điện đến khi hiện màu.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 29 cũ để xỏc định vựng chất, tiếp theo cạo lớp Silicagel cú chất, giải hấp phụ bằng dung mụi thớch hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường cú cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).
2.3. Phương phỏp xỏc định cấu trỳc hoỏ học cỏc hợp chất.
2.3.1. Điểm núng chảy (Mp)
Điểm núng chảy được đo điểm núng chảy Mel – Temp 3.0 (Thermo Scientific).
2.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS)
Phổ khối lượng phun mự điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra) được đo trờn mỏy AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap của Viện Hoỏ học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C- NMR (125 MHz) được đo trờn mỏy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn độ nội là tetramethylsiane của Viện Húa học, Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.3.4. Độ quay cực []D
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 30
2.4. Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tỏch chiết
Cỏc dụng cụ và thiết bị dựng cho tỏch chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
- Bỡnh chiết 30 lớt - Bếp điện
- Đốn tử ngoại hai bước súng 254 và 368 nm - Bỡnh sắc ký loại phõn tớch và điều chế - Cột sắc ký pha thường cỏc loại đường kớnh - Cột sắc ký pha ngược trung ỏp
- Mỏy cụ quay chõn khụng - Mỏy phun dung dịch thuốc thử - Mỏy sấy
- Micropipet
- Tủ sấy chõn khụng
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xỏc định cấu trỳc
- Mỏy phổ cộng hưởng từ hạt nhõn NMR AM500 FT-NMR spectrometer. - Mỏy sắc ký lỏng cao ỏp ghộp nối khối phổ (ESI) AGILENT 1200 LC-MSD Trap spectrometer.
- Thiết bị đo độ quay cực JASCO P 20000.
-Thiết bị đo điểm núng chảy Kofler micro-hotstage.
2.5. Hoỏ chất.
- Bản mỏng trỏng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715). - Bản mỏng trỏng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck).
- Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
- Cỏc loại dung mụi hữu cơ như methanol, etanol, ethyl acetate, chloroform, hexane, acetone, v.v... là loại hoỏ chất tinh khiết của Merck.
- Silica gel 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 31 xay nhỏ thành bột thu được 2 kg bột khụ.
Phần bột khụ được ngõm chiết với metanol (5 L x 3 lần) trong bể siờu õm ở nhiệt độ 40-50oC, mỗi lần 60 phỳt. Phần dịch chiết được cất loại dung mụi dưới ỏp suất giảm thu được dịch cao chiết metanol 160 g. Cao chiết được hoà với nước (1 lớt) rồi chiết phõn đoạn lần lượt với n-hexan (1L x 3) và clofoc (1L x 3) thu được cỏc cắn chiết n-hexan (60 g), cắn clofoc (10 g) và cắn nước tương ứng. Phần dịch nước được lọc qua cột dianion và rửa giải lần lượt bằng nước, metanol:nước 50% và 100% metanol thu được phõn đoạn A1-A3. Tiến hành sắc ký cột với silicagel đối với phõn đoạn A3 rửa giải bằng hệ dung mụi gradient clofoc:metanol (100:1 v/v → 100% metanol) thu được 5 phõn đoạn ký hiệu B1- B5.Tinh chế phõn đoạn B3 lần lượt qua cỏc cột YMC-RP18 (metanol:nước 1:3 v/v) và qua cột silica gel với dung mụi rửa giải clofoc:metanol:nước 5:1:0.1 (v/v) thu được hợp chất 1 (10 mg). Tinh chế B2 qua cột YMC- RP18 với hệ dung mụi rửa giải metanol:nước 1:3 v/v thu được hai phõn đoạn C11 và C12. Tinh chế lại C12 trờn cột silica gel sử dụng dung mụi rửa giải n-hexan:clofoc:metanol 10.5:1:1 (v/v/v) thu được hợp chất 2 (15 mg).
3.2. Hằng số vật lý và cỏc dữ kiện phụ̉ của cỏc hợp chất
3.2.1. Hợp chất 1
Cỏc thụng số vật lý của hợp chất (1),cỏc số liệu như sau: - Chất bột màu vàng
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 32 - Phổ khối lượng ESI-MS (negative) m/z:446,8 [M-H]-
- Tờn khoa học: 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside (1)
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) (ppm): 7,37 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6′), 7.36 (1H, br s, H-2′), 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′), 6.53 (1H, s, H-8), 6.47 (1H, s, H-3), 4.90 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.20 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-2′′), 3.91 (1H, dd, J = 1.5, 12.0 Hz, H-6′′b), 3.76 (1H, dd, J = 5.5, 12.0 Hz, H-6′′a), 3.50 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-3′′), 3.49 (1H, m, H-4′′), 3.45 (1H, m, H-5′′). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm): 166,2 (C-2), 103,8 (C-3), 183,9 (C-4), 162,0 (C-5), 109,1 (C-6), 165,1 (C-7), 95,2 (C-8), 158,7 (C-9), 105,1 (C-10), 123,5 (C-1′), 114,1 (C-2′),147,0 (C-3′), 151,0 (C-4′),116,7 (C- 5′), 120,3 (C-6′), 75,3 (C-1′′), 71,7 (C-2′′), 80,1 (C-3′′), 72,6 (C-4′′), 82,6 (C- 5′′) và 62,8 (C-6′′). 3.2.2. Hợp chất 2
Cỏc thụng số vật lý của hợp chất (2), cỏc số liệu như sau: - Chất bột màu vàng
- Điểm núng chảy mp: 240-242oC
- Phổ khối lượng ESI-MS (positive) m/z: 454,9 [M+Na]+
- Tờn khoa học: 4',5,7-trihydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside (2)
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 7.78 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.44 (1H, s, H-3), 6.33 (1H, s, H-8), 4.90 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.33 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-2′′), 3.87 (1H, dd, J
= 1.5, 12.0 Hz, H-6′′b), 3.80 (1H, dd, J = 5.5, 12.0 Hz, H-6′′a), 3.57 (1H, m, H-4′′), 3.48 (1H, t, J = 9.0 Hz, H-3′′), 3.44 (1H, m, H-5′′).
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 33 5′′) và 62,5 (C-6′′).
3.3. Đỏnh giỏ tỏc dụng quột gốc tự do DPPH
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) cú khả năng tạo ra cỏc gốc tự do bền trong dung dịch MeOH. Cỏc chất cú khả năng làm trung hoà hoặc bao võy cỏc gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ỏnh sỏng của cỏc gốc tự do DPPH. Hoạt tớnh chống oxy hoỏ được đỏnh giỏ thụng qua giỏ trị hấp phụ ỏnh sỏng của dịch thớ nghiệm so với đối chứng khi đo ở bước súng 517nm [15]. Theo đú, 10 àl mẫu pha trong DMSO (dimethyl sulfoxid) được cho vào cỏc giếng của phiến 96 giếng chứa 190 àl dung dịch 150 àM DPPH/MeOH. Sau 30 phỳt ủ trong búng tối ở nhiệt độ phũng, độ hấp thụ của cỏc dung dịch phản ứng được đo trờn mỏy ELISA ở bước súng 517nm. Kết quả được biểu thị bằng giỏ trị scavenging capactity (SC50). Hoạt chất catechin được sử dụng làm đối chứng dương.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 34
CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Xỏc định cấu trỳc húa học của hợp chất 1.
Hợp chất 1 thu được dưới dạng chất bột màu vàng, phổ khối lượng phun mự điện tử cú pớc ion giả phõn tử [M-H]- tại m/z 446,8 chứng tỏ 1 cú khối lượng phõn tử 448. Trờn phổ 1H-NMR (hỡnh 4.1.2) của 1, tại vựng
trường thấp cú 5 tớn hiệu của olefin vũng thơm gồm cú hai proton dạng singlet tại 6.47 (1H, s, H-3), 6.53 (1H, s, H-8), một hệ vũng thơm kiểu ABX tại H 7.36 (1H, br s, H-2'), 7.37 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6'), và 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5'). Ngoài ratại vựng trường trung bỡnh 3.44-4.90 cũn cú cỏc tớn hiệu proton của một nhúm đường.
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 35 cho một đơn vị đường C-glucospyranosit [17]. Cũn lại 15 vạch tớn hiệu phự hợp với cấu trỳc của một flavonoit cú vũng B thế 1,3,5. So sỏnh cỏc dữ kiện phổ trờn với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất 1 là 3',4',5,7- tetrahydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside [16].
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 36
Hỡnh 4.1.3. Phụ̉ 13C-NMR của hợp chất 1
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 37
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 38
Bảng 1. Số liệu phụ̉ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 1, hợp chất 2 phõn lập từ lỏ Kim tiền thảo
1 2 C H ppm (J, Hz) C ppm H ppm (J, Hz) C ppm 2 - 166.2 - 165.42 3 6.47 s 103.8 6.44 s 103.02 4 - 183.9 - 183.1 5 - 162.0 - 161.9 6 - 109.1 - 110.2 7 - 165.1 - 165.4 8 6.53 s 95.2 6.33 s 96.9 9 - 158.7 - 159.2 10 - 105.1 - 103.8 1′ - 123.5 - 122.8 2′ 7.36 s 114.1 7.78 (d, J = 8.5) 129.1 3′ - 147.0 6.90 (d, J = 8.5) 117.2 4′ - 151.0 - 163.5 5′ 6.90 (d, 8.5) 116.7 6.90 (d, J = 8.5) 117.1 6′ 7.37 (d, 8.5) 120.3 7.78 (d, J = 8.5) 129.1 1′′ 4.90 (d, J = 7.5) 75.3 4.90 (d, J = 7.5) 75.6 2′′ 4.20 (t, J = 8.5) 71.7 4.33 (t, J = 8.5) 72.3 3′′ 3.50 (t, J = 8.5) 80.1 3.48 (t, J = 9.0) 80.5 4′′ 3.49 m 72.6 3.57 m 71.5 5′′ 3.45 m 82.6 3.44 m 82.3 6′′ 3.76 (dd, J = 5.5, 12.0, H-6a′′) 62.8 3.80 (dd, J = 5.5, 12.0, H-6a′′) 62.5 3.91 (dd, J = 1.5, 12.0, H-6b′′) 3.86 (dd, J = 1.5, 12.0, H-6b′′)
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 39
Hỡnh 4.2.1. Phụ̉ ESI-MS của hợp chất 2
Cỏc phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 2 tương tự như cỏc phổ tương ứng của 1 cho phộp xỏc định hai hợp chất cú cấu trỳc tương tự nhau (Bảng 1). Sự khỏc biệt dễ nhận thấy nhất nằm ở cỏc tớn hiệu của vũng B với sự xuất hiện tớn hiệu của hai cặp proton hệ A2B2, cú tương tỏc vị trớ ortho với nhau tại δC 129.1 (C-2', 6')/δH 7.78 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2, 6) và δC 117.2 (C-3', 5')/δH 6.90 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3', 5'). Số liệu này cho phộp xỏc định hợp chất 2 là
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 40
Hỡnh 4.2.2. Phụ̉ 1H-NMR của hợp chất 2
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 41
Hỡnh 4.2.4. Phụ̉ DEPT của hợp chất 2
K35C – Khoa Húa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 42
4.3 Kết quả đỏnh giỏ hoạt tớnh quột gốc tự do DPPH
Kết quả thử nghiệm hoạt tớnh chống oxi húa của cỏc hợp chất phõn lập được cho thấy hợp chất 1 cú khả năng quột gốc tự do DPPH tương đối mạnh cũn 2 khụng cú tỏc dụng. Giỏ trị SC50 của hợp chất 1 là 3,71 àg/ml thấp hơn nhiều so với đối chứng dương catechin là 15,13 àg/ml (Hỡnh 4.3). Đỏng chỳ ý hợp chất 1 cú số nhúm hydroxy ở vũng B nhiều hơn so với 2 và thể hiện