c. Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:
1.3.2.2 Phương pháp phổ
Sử dụng các phƣơng pháp phổ để có thể xác định cấu trúc của một hợp chất hữu cơ.
PHỔ MS
Cho thông tin về khối lƣợng phân tử và sự phân mảnh khi bắn phá cấu trúc
PHỔ IR
Cho thông tin về sự hiện diện của các nhóm chức, nối kép
PHỔ UV-VIS
Cho thông tin về sự hiện của các cấu trúc chứa nối đôi liên hợp
PHỔ 1
H-NMR
Cho thông tin về các proton 1H có trong phân tử. Các thông số của phổ 1
H- NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học, hình dạng tín hiệu và hằng số tƣơng tác (J) spin – spin giữa các proton không tƣơng đƣơng kế cận nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ (tín hiệu bội), cƣờng độ tích phân của tín hiệu thể hiện số lƣợng proton tƣơng ứng với tín hiệu đó.
PHỔ 13
C-NMR
Cho thông tin về khung carbon của phân tử. Các tín hiệu phổ 13
C-NMR xuất hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0 - 250 ppm) (có thể đến 600 ppm cho trƣờng hợp đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát. Mỗi loại carbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của carbon trong phổ 13
C-NMR, có thể dự đoán đƣợc loại carbon và liên kết của carbon đó.
Phổ 13
C-NMR DEPT cũng là một dạng phổ 13C-NMR, thực hiện đồng thời
cả 2 phổ 1
H-NMR và 13C-NMR. Kỹ thuật này cho các tín hiệu carbon gắn với 1, 2
hoặc 3 hydro.
PHỔ HSQC VÀ HMBC
Khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13
C.
Phổ HSQC cho tín hiệu của carbon gắn trực tiếp vào proton, nghĩa là tƣơng tác ngang qua 1 nối hóa trị.
Phổ HMBC cho biết tƣơng tác xa, ngang qua 2 hoặc 3 nối hóa trị và không xuất hiện tín hiệu tƣơng tác ngang qua 1 nối hóa trị.
PHỔ COSY
THỰC NGHIỆM 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Nguyên liệu
2.1.1.1 Thu hái nguyên liệu
Mẫu thực vật đƣợc dùng trong đề tài là trái quách già và chín(khoảng 5 đến 6 tháng tuổi) đƣợc thu hái tại huyện Cầu Kè, tỉnh Trà Vinh.
Thời gian thu hái: tháng 5 năm 2014.
2.1.1.2 Xử lý mẫu nguyên liệu
Mẫu nguyên liệu đƣợc rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh. Toàn bộ trái quách đƣợc tách ra, phơi khô trong bóng râm rồi sấy lại ở 50°C. Sau khi sấy khô rồi đƣợc xay thành bột mịn. Đây là nguyên liệu dùng trong đề tài.
2.1.2 Hóa chất
- Ethanol 96°, Việt Nam
- Silica gel 60 F254, Scharlau, đƣờng kính hạt 0.04 - 0.06 mm
- n-hexan, Trung Quốc
- Methanol, Trung Quốc
- Chloroform, Trung Quốc
- Ethyl acetate, Trung Quốc
- Petroleum ether, Trung Quốc
- Na2SO4 khan, Trung Quốc
- H2SO4 98%, d = 1,84 g/mL, Trung Quốc
- DPPH, Merck
- Ethanol tuyệt đối, Merck
2.1.3 Thiết bị
- Máy cô quay chân không BUCHI Ratavapor R – 200
- Bản silica gel 60 F254, MERCK tráng sẵn
- Đèn UV: MINERALIGHT® LAMP, U.S.A Bƣớc sóng 254, 365 nm
- Bình phun xịt thuốc thử
- Tủ hút MEMMERT
- Máy sấy
- Máy đánh siêu âm
- Cân phân tích AB 265-S và cân kỹ thuật PB 602-S
- Bếp điện dùng để nƣớng bản mỏng Blacker®
- Các loại cột sắc ký
- Các máy đo phổ IR, UV, MS, NMR
- Dụng cụ thủy tinh:
Phễu lọc
Bình sắc ký
Ống nghiệm, đũa thủy tinh
Cốc 100mL, 250mL, 500mL
Bình lóng 1000 mL
Ống đong 10 mL, 100 mL, 500 mL
Erlen 100mL, 250mL, 500mL
Bình cô quay loại 50, 100, 250, 500, 1000 Ml
2.2 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
2.2.1 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của trái quách [4]
2.2.1.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất steroid
Cân 1g bột khô, cho vào 20 mL CHCl3 và ngâm trong 2 giờ. Sau đó lọc lấy dịch trong là mẫu thử.
- Salkowsky: H2SO4đđ (1 mL)
- Libermann-Burchard: (CH3CO)2O (20 mL), H2SO4đđ (1 mL)
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1 mL các thuốc thử theo thành ống nghiệm. Để yên quan sát.
- Thuốc thử Salkowsky: Nếu dung dịch có màu đỏ đến nâu đỏ là dƣơng
tính.
- Thuốc thử Libermann-Burchard: Nếu thấy xuất hiện một vòng ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng có màu từ hồng đến xanh lá là dƣơng tính.
2.2.1.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid
Đun hoàn lƣu 5g bột mẫu trong 50 mL EtOH 95% trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử: HClđđ + Mgbột + alcol isoamylic, dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa, dung dịch FeCl3 1%.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch mẫu, thêm vài giọt HClđđ, sau đó cho một ít bột Mg vào và lắc. Thêm từ từ từng giọt alcol isoamylic, để yên quan sát nếu thấy xuất hiện vòng màu hồng hay dung dịch có màu tím thì có flavonoid trong mẫu.
Dung dịch mẫu tạo kết tủa màu xanh lục đen với dung dịch FeCl3 1%, kết tủa trắng với dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa.
2.2.1.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alcaloid
Cân 5g bột khô ngâm với 80 mL HCl 1% trong 4-6 giờ. Lọc lấy dịch trong làm thuốc thử.
Thuốc thử:
- Wasicky: p-dimethyl amino benzaldehyde (20g), H2SO4đđ (60g), H2O (10 mL).
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1 mL các thuốc thử theo thành ống nghiệm, lắc đều, để yên, quan sát.
- Thuốc thử Wasicky: Có kết tủa hình bông sao là dƣơng tính.
- Thuốc thử Bouchardat: Cho kết tủa màu nâu hoặc vàng đậm là dƣơng
tính.
2.2.1.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin
Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin
Cơ sở của phƣơng pháp: Dƣợc điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nƣớc để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thƣớc xác định, tiến hành trong điều kiện quy định.
Cách tiến hành: Cân 1g bột dƣợc liệu cho vào erlen 500 mL chứa sẵn 100 mL nƣớc sôi. Tiếp tục cho nƣớc trong erlen sôi trong 30 phút nữa. Lọc, để nguội, thêm nƣớc cất cho đến 100 mL. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đƣờng kính 16mm. Cho vào các ống nghiệm lần lƣợt 1, 2, 3, 4, 5,..., 10 mL dịch lọc. Thêm nƣớc cất vào mỗi ống cho đủ 10 mL. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Mỗi giây lắc 2 lần. Để yên trong 15 phút. Sau đó đo chiều cao các cột bọt.
Chỉ số bọt đƣợc tính theo công thức:
CSB = 100.(10/i)
Trong đó: CSB: Chỉ số tạo bọt.
i: ống nghiệm thứ i có cột bọt cao 1cm.
Nếu cột bọt trong các ống nghiệm thấp dƣới 1cm (tức chỉ số tạo bọt dƣới 100) thì coi nhƣ không có saponin.
Dựa vào các phản ứng đặc trƣng
Cân 5g bột khô, thêm vào 50 mL EtOH 70° và đun cách thủy sôi trong 5 phút rồi lọc. Cô cạn dƣới áp suất kém đến cặn khô. Cặn khô này dùng làm mẫu thử.
Tiến hành: Hòa mẫu bằng 1 mL (CH3CO)2O, thêm từ từ 0,3-0,5 mL H2SO4đđ. Nếu xuất hiện vòng ngăn cách:
- Có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpenoid.
- Có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid.
2.2.1.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin
Cân 5g bột khô, thêm vào 100 mL nƣớc cất, đun sôi trong 10 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử:
- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Pha đến bão hòa trong nƣớc.
- Dung dịch FeCl3: Pha nồng độ 1% trong nƣớc.
Tiến hành: Lấy 2 mL dung dịch lọc, thêm 2-4 giọt dung dịch thuốc thử.
- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt là dấu hiệu dƣơng tính.
- Dung dịch FeCl3: Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh đen hoặc lục
đen (do tạo phức) là dấu hiệu dƣơng tính.
2.2.1.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside
Lấy 10g bột khô loại các chất không phân cực bằng PE. Tiếp theo chiết với EtOH 50%. Dịch lọc đƣợc loại tạp chất bằng (CH3COO)2Pb cho đến khi không còn trầm hiện. Sau đó loại (CH3COO)2Pb dƣ bằng Na2SO4 bão hòa. Cô cạn dịch lọc đƣợc cao glycoside thô. Hòa tan cao này bằng EtOH 90% và lấy dung dịch này làm mẫu thử.
Thuốc thử:
- Tollens: dung dịch AgNO3 10% (1 mL) + dung dịch NaOH 10% (1 mL)
+ dung dịch NH4OH 25% từ từ từng giọt.
- Fehling:
- Dung dịch B: KNaC4H4O6.4H2O (200g) + NaOH (150g) + H2O, định mức vừa đủ 1 lít.
Khi sử dụng thì trộn hai dung dịch lại với nhau.
Tiến hành: Lấy 1 mL mẫu thử, cho vào từng giọt cho đến hết 1 mL các thuốc thử.
- Thuốc thử Tollens: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu bạc là dấu hiệu dƣơng tính.
- Thuốc thử Fehling: Đun sôi ống nghiệm trên đèn cồn trong 1 phút. Nếu
thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ là dƣơng tính.
2.2.1.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất coumarine
Đun hoàn lƣu 5g bột mẫu trong 50 mL EtOH 95% trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử: dung dịch NaOH 10% (0,5 mL), HClđđ (vài giọt), H2O (12 mL), dung dịch Na2CO3 10% (2 mL).
Tiến hành:
- Phản ứng mở vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 mL dịch
thử, thêm vào 1 trong 2 ống 0,5 mL dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội, thêm vào mỗi ống 4 mL H2O. Nếu chất lỏng trong ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dƣơng tính. Tiếp tục đem acid hóa ống có kiềm với vài giọt HClđđ, nếu dung dịch đang trong suốt lại xuất hiện vẩn đục hoặc kết tủa thì đó là dấu hiệu dƣơng tính.
- Phản ứng diazo hóa: Lấy 2 mL mẫu vào ống nghiệm, thêm vào 2 mL
dung dịch Na2CO3 10% và 4 mL H2O. Đun cách thủy rồi để nguội, thêm vào dung dịch vài giọt thuốc thử diazo. Có thể dùng thuốc thử diazo của paranitroanilin hoặc của acid sulfanilic. Màu bền và màu thay đổi tùy theo cấu trúc từ vàng, cam, đỏ cam, hồng, đỏ là dƣơng tính.
Bột trái quách (1,8 kg) đƣợc tận trích với ethanol 96° bằng phƣơng pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết đƣợc cô loại dung môi dƣới áp suất kém thu đƣợc cao EtOH dạng sệt có khối lƣợng 150 g.
Đem cao EtOH chiết lần lƣợt với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethyl acetate, n-butanol.
Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết với 3 lít n-hexane đem cô loại dung môi dƣới áp suất kém thu đƣợc cao n-hexane có khối lƣợng 12,4 g.
Phần không tan trong n-hexane đƣợc chiết với 4 lít ethyl acetate. Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết, đem cô loại dung môi dƣới áp suất kém thu đƣợc cao EtOAc có khối lƣợng 32,7 g.
Phần không tan trong ethyl acetate tiếp tục đƣợc chiết với 4 lít n-butanol. Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết, đem cô loại dung môi dƣới áp suất kém thu đƣợc cao n-butanol có khối lƣợng 25,5 g.
Sơ đồ 1 Quy trình điều chế các cao thô từ nguyên liệu
- Chiết với EtOAc (4 lít)
- Cô cạn dƣới áp suất thấp
- Chiết với n-butanol (4 lít)
- Cô cạn dƣới áp suất thấp
Phần không tan trong n- butanol (34,2 g)
Cao n-butanol (25,5 g) Phần không tan trong
EtOAc (70,8g) g)
Cao EtOAc (32,7 g) Bã chiết EtOH
- Chiết với n-hexane (3 lít)
- Cô cạn dƣới áp suất thấp
Bột trái quách (1,8 kg)
Cao EtOH (150 g)
- Tận trích bằng EtOH 96°
- Lọc bỏ bã, cô cạn dƣới áp suất thấp
Phần không tan trong n-hexane (120,3 g)
Cao n-hexane (12,4 g)
Tiến hành sắc ký cột cao FB (25,5 g) Các thông số cột nhƣ sau: 180g silica gel 0,04 – 0,06 Kích thƣớc cột 40 x 300 (mm x mm) Khối lƣợng mẫu 25 g Tốc độ dòng 40 mL / phút
Hệ dung môi giải ly EtOAc:MeOH (E:M) với các tỉ lệ thay đổi theo hƣớng tăng dần độ phân cực
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng (TLC), hiện vết bằng cách phun xịt dung dịch axit sunfuric 10% trong EtOH và hơ nóng trên bếp điện.
Các phân đoạn giống nhau trên TLC đƣợc gom chung lại thành 9 phân đoạn (kí hiệu từ FB1 đến FB9). Quá trình thực hiện đƣợc tóm tắt trong Sơ đồ 2 và Bảng 2.
Sơ đồ 2 Quy trình cô lập và tinh chế hợp chất từ cao FB Cao FB (25g) FB1 (0,068g) FB2 (1,223g) FB3 (3,37g) FB4 (1,214g) FB5 (2,113g) FB6 (1,025g) FB7 (0,986g) FB8 (3,057g) FB9 (2,132g) FB3.1 (0,154g) FB3.2 (1,86g) FB3.3 (0,135g) FB3.4 (0,253g) FB3.5 (0,578g) LAFB02 (0,031g) LAFB01 (0,015g) FB3.2.1 (0,583g) FB3.2.2 (0,051g) FB3.2.3 (0,986g) FB8.1 (0,083g) FB8.2 (0,825g) FB8.3 (0,908g) FB8.4 (0,976g)
Bảng 2 Kết quả sắc ký cột MPLC cao FB
2.2.3.1 Phân đoạn FB3
Sắc ký bản mỏng của phân đoạn FB3 nhận thấy có một vết chính màu đen và nhiều vết mờ. Tiếp tục tiến hành sắc ký cột phân đoạn FB3 với máy sắc ký cột MPLC. Các thông số cột: - 80 g silica gel 0.04 - 0.06 - Kích thƣớc cột 40 x 200 (mm x mm) - Khối lƣợng mẫu 3,37g - Tốc độ dòng 5 mL / phút
- Hệ dung môi giải ly: CHCl3 100%
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng (TLC), hiện vết bằng đèn UV và cách phun xịt dung dịch axit sunfuric 10% trong EtOH, hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện. Các phân đoạn giống nhau trên TLC gom chung lại thành 5 phân
Phân đoạn (PĐ) Khối lƣợng (g) Hệ dung môi Kết quả kiểm tra với TLC
FB1 0,068 EtOAc 100% Vết kéo dài
FB2 1,223 EtOAc 100% Nhiều vết đậm
FB3 3,370 EtOAc 100% 1 vết chính màu đen
và nhiều vết mờ
FB4 1,214 E:M (95:5) Nhiều vết mờ
FB5 2,113 E:M (9:1) Nhiều vết đậm
FB6 1,025 E:M (85:5) Vết kéo dài
FB7 0,986 E:M (8:2) Nhiều vết mờ
FB8 3,057 E:M (8:2) 1 vết chính màu đen
và vết kéo dài
FB9 2,132 E:M (8:2) Nhiều vết đậm
Bảng 3.
Bảng 3 Kết quả sắc ký cột MPLC phân đoạn FB3 (3,37 g)
Hiệu suất thu hồi cột sắc ký: H = 2,98/3,37 = 88,43% Phân đoạn FB3.2 tiếp tục sắc ký cột silica gel nhƣ sau:
Các thông số cột:
- 50g silica gel 0.04 - 0.06
- Kích thƣớc cột 40 x 200 (mm x mm)
- Khối lƣợng mẫu 1,86 g
- Tốc độ dòng 5 mL / phút
- Hệ dung môi giải ly: C:M = 9:1
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng (TLC), hiện vết bằng đèn UV và cách phun xịt dung dịch axit sunfuric 10% trong EtOH và hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện. Các phân đoạn giống nhau trên TLC đƣợc gom chung lại thành 3 phân đoạn con (kí hiệu từ FB3.2.1 đến FB3.2.3). Quá trình thực hiện đƣợc tóm tắt trong Bảng 4.
Phân đoạn Khối lƣợng (g) Hệ dung môi Kết quả kiểm tra với TLC
FB3.1 0.154 CHCl3 100% Nhiều vết FB3.2 1,86 CHCl3 100% 1 vết chính màu đen FB3.3 0,135 CHCl3 100% Nhiều vết FB3.4 0,253 CHCl3 100% Nhiều vết FB3.5 0,578 CHCl3 100% Nhiều vết Tổng cộng 2,98
Bảng 4 Kết quả sắc ký cột MPLC phân đoạn FB3.2 (1,86 g)
Hiệu suất thu hồi cột sắc ký: H = 1,62/1,86 = 87,1%
Phân đoạn FB3.2.2, làm sạch bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong CHCl3 thu đƣợc các tinh thể hình kim màu trắng (15mg), đặt tên là LAFB01.
2.2.3.2 Phân đoạn FB8
Sắc ký bản mỏng của phân đoạn FB8 nhận thấy có một vết chính màu đen và vết kéo dài. Tiếp tục tiến hành sắc ký cột phân đoạn FB8 với máy sắc ký cột MPLC. Các thông số cột: - 80 g silica gel 0.04 - 0.06 - Kích thƣớc cột 40 x 200 (mm x mm) - Khối lƣợng mẫu 3,057g - Tốc độ dòng 5 mL / phút
- Hệ dung môi giải ly: C:M = 85:15
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng (TLC), hiện vết bằng đèn