Kết quả cho thấy cho thấy tỷ lệ chết của các chép ở nồng độ 10,5 mg/L là 20%, ở nồng độ 13 mg/L là 90% và ở nồng độ 13,5 mg/L hay cao hơn nữa thì cá chết 100% cá thí nghiệm (Bảng 4.1). Qua đó ta chọn đƣợc khoảng nồng độ cá chết 10% đến 90% là từ 10,2 mg/L đến 13 mg/L để bố trí thí nghiệm xác định LC50. Bảng 4.1: Tỷ lệ chết của cá chép ở các nồng độ xác định khoảng gây độc
STT Iprobenfos(mg/L) Tỷ lệ chết (%) 1 Đối chứng 0 2 10 0 3 10,5 20 4 11 40 5 11,5 60 6 12 80 7 12,5 80 8 13 90 9 13,5 100 10 14 100 4.2 Nồng độ Iprobenfos gây chết 50% cá chép (LC50)
4.2.1 Nhiệt độ, pH và oxy hòa tan trong thời gian thí nghiệm
Trong thời gian thí nghiệm, các yếu tố môi trƣờng nƣớc nhƣ nhiệt độ dao
động từ 28,13 ± 0,06 0
C vào buổi sáng (7 - 8 giờ) đến 29,96 ± 0,07 0C (14 - 15 giờ)
buổi chiều (Bảng 4.2). Do hệ thống thí nghiệm đƣợc bố trí dƣới mái che nên nhiệt độ khá đồng nhất giữa các nghiệm thức. Nhiệt độ trung bình buổi chiều cao hơn
nhiệt độ trung bình buổi sáng không quá 2 0C. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển
của cá chép là 23 - 300C (FAO, 2011). Do đó cá vẫn phát triển tốt và không ảnh
Bảng 4.2: Nhiệt độ, oxy hòa tan, pH trong thí nghiệm xác định LC50 – 96giờ
Iprobenfos (mg/L)
DO (mg/L) Nhiệt độ (0C) pH
Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều
0 4,32 ± 0,11 3,65±0,096 28,13 ± 0,16 29,88 ± 0,16 6,73 ± 0,05 6,69±0,046 10,2 4,39 ± 0,11 3.63±0,096 28,13 ± 0,16 29,88 ± 0,16 6,64 ± 0,03 6,61 ± 0,03 10,8 4,34 ± 0,12 3,52 ± 0,11 28,13 ± 0,16 29,88 ± 0,16 6,61 ± 0,02 6,66 ± 0,04 11,4 4,23 ± 0,14 3,59 ± 0,12 28,13 ± 0,16 29,88 ± 0,16 6,64 ± 0,02 6,71 ± 0,04 12,1 4,2 ± 0,14 3,64 ± 0,11 28,13 ± 0,16 29,88 ± 0,16 6,71 ± 0,02 6,75 ± 0,04 12,8 4,25 ± 0,12 3,63 ± 0,15 28,13 ± 0,13 30,38 ± 0,13 6,71 ± 0,03 6,84±0,044 (Trung bình SE, n=12)
Oxy hòa tan (DO) buổi sáng dao động từ 4,2 ± 0,14 - 4,39 ± 0,11mg/L; buổi chiều dao động từ 3,52 ± 0,11 - 3,65 ± 0,096 mg/L (Bảng 4.2). Theo thí nghiệm cho thấy DO buổi sáng cao hơn DO buổi chiều. Do nhiệt độ chiều cao hơn so với buổi sáng nên làm DO buổi chiều thấp hơn. Đồng thời trong thí ngiệm các bể không đƣợc sục khí nên oxy chủ yếu khuếch tán từ không khí vào bể và sự tiêu hao oxy do hô hấp của cá nên lƣợng oxy trong nƣớc ngày càng giảm nên DO thấp và giảm dần. Trên thực tế DO lý tƣởng cho các loài sinh vật sinh trƣởng là 5 mg/L. Cá chép sống đƣợc ở hàm lƣợng oxy hòa tan thấp (0,3 - 0,5 mg/L) cũng nhƣ oxy bão hòa nên không ảnh hƣởng đến hoạt động của cá. DO thấp sẽ làm cá tăng cƣờng độ hô hấp và làm độc chất hấp thụ vào cơ thể nhanh hơn, gây độc đến cá nhanh hơn.
Giá trị pH buổi sáng dao động từ 6,61 ± 0,02 - 6,73 ± 0,05 và buổi chiều dao dộng từ 6,61 ± 0,03 đến 6,84 ± 0,044. pH thích hợp đối với sự phát triển bình thƣờng của cá chép là 6,5 - 9 (FAO, 2011). Cá chép bột sẽ không tồn tại trong môi trƣờng có pH thấp (pH < 4,5). Tuy nhiên, khả năng chịu đựng pH của cá chép sẽ tăng dần theo giai đoạn phát triển của cơ thể và ổn định từ sau giai đoạn cá giống (Nguyễn Văn Kiểm, 2004). Do đó cá vẫn có thể sống và phát triển ở điều kiện pH này.
4.2.2 Kết quả thí nghiệm LC50 - 96 giờ
a. Biểu hiện của cá chép khi tiếp xúc với thuốc
Theo dõi hoạt động của cá trong thời gian thí nghiệm cho thấy cá trƣớc khi tiếp xúc với thuốc trừ sâu hoạt chất iprobenfos thì bơi lội nhanh nhẹn, cá thƣờng bơi tập trung thành nhóm ở đáy bể. Khi cá tiếp xúc với thuốc sau khoảng 20 - 30 phút thì cá có biểu hiện bơi lội phân tán, một số cá có biểu hiện bơi nhanh, bơi lội mất thăng bằng. Sau gần 1 giờ thì nhận thấy một số cá có biểu hiện bơi lờ đờ trên mặt nƣớc; biểu hiện cá sắp chết là cá chìm xuống đáy bể, hô hấp yếu dần và chết. Cá chết thƣờng nằm trên mặt nƣớc và ở đáy bể. Cá chết tập trung chủ yếu lúc 3 giờ đến 48 giờ, sau đó số cá chết ở các nghiệm thức có dấu hiệu chậm lại.
Theo Đỗ Thị Thanh Hƣơng (1997) khi nghiên cứu ảnh hƣởng của Basudin lên hoạt động của cá chép trong bể kính thì thấy ở nồng độ thuốc cao (3,7 mg/L) thì cá bị co giật không điều khiển đƣợc hoạt động cơ thể, di chuyển chậm chạp hoặc
mất thăng bằng. Cong et al., (2006) ghi nhận khi cho cá lóc tiếp xúc với diazinon ở
nồng độ 0,52 mg/L thì cá có biểu hiện bất động ở giữa bể. Đỗ Văn Bƣớc (2010)
nghiên cứu hoạt động của cá rô phi Oreochromis niloticus khi tiếp xúc với thuốc trừ
sâu hoạt chất quinalphos (gốc lân hữu cơ) cho thấy vào thời điểm 24 giờ, ở nồng độ thuốc 0,84 mg/L, cá có biểu hiện bơi lội bất thƣờng, mất định hƣớng. Sau 30 giờ, ở nồng độ cao nhất 0,84 mg/L cá bắt đầu chết. Cá sắp chết thì bơi lội yếu dần, dần dần chìm xuống đáy bể. Bradbury and Coats (1989) cho rằng các dấu hiệu nhiễm độc fenvalerate ở cá khi cá bơi gần mặt nƣớc, bơi lội bất thƣờng, co giật, lờ đờ trƣớc khi
chết (Trích dẫn của Velisek et al., 2009a). Từ các kết quả các nghiên cứu trên cho
thấy độc tính của thuốc trừ sâu làm thay đổi hoạt động bơi lội bình thƣờng của cá thậm chí tử vong tùy thuộc loài cá, loại thuốc, nồng độ thuốc.
b. Tỷ lệ chết của cá trong 96 giờ và giá trị LC50
Trong suốt quá trình thí nghiệm không xuất hiện cá chết ở nghiệm thức đối chứng. Tính đến thời điểm 3 giờ sau khi bố trí, ở nồng độ Iprobenfos cao nhất (12,8 mg/L) cá chết khoảng 43,33%, ở nồng độ thấp nhất (10,2 mg/L) thì không cá cá chết. Tỷ lệ chết tăng dần và đạt cao nhất ở thời điểm 48 giờ, tỷ lệ chết ở nồng độ cao nhất cá chết 70% và nồng độ thấp nhất (10,2 mg/L) cá chết 13,33%. Tỷ lệ cá chết tăng dần theo nồng độ Iprobenfos và thời gian tiếp xúc nhƣng luôn theo trình tự nồng độ càng cao tỷ lệ chết càng nhiều (Bảng 4.3). Sau 72 giờ tiếp xúc, cá vẫn tiếp tục chết nhƣng chậm lại đên thời điểm 96 giờ thì tỷ lệ chết ở nồng độ cao nhất 12,8 mg/L là 90 %, ở các mức nồng độ còn lại cá không chết nữa nên tỷ lệ chết
Bảng 4.3: Tỷ lệ cá chết (%) ở các mức nồng độ Iprobenfos khác nhau
Từ kết quả ƣớc tính đƣợc nồng độ gây chết 50% cá chép cho thấy LC50 ở 24 và 36 giờ là 12,2 mg/L, 11,1 mg/L ở 48 giờ, đến 72 giờ giảm còn 11,0 mg/L và tiếp tục giảm đến 96 giờ còn 10,9 mg/L (Bảng 4.4). Giá trị LC50 giảm dần theo thời gian phơi nhiễm. Điều này cho thấy Iprobenfos là loại thuốc có tính gây độc nhanh với cá chép và kéo dài.
Bảng 4.4: Nồng độ Iprobenfos gây chết 50% cá chép từ 48 giờ - 96 giờ
Nồng độ gây chết (LC) Iprobenfos (mg/L) Khoảng tin cậy 95 %
LC50-24h 12,2 11,7 – 13,5
LC50-36h 11,2 10,3 – 11,9
LC50-48h 11,1 10,0 – 11,7
LC50-72h 11,0 9,8 – 11,6
LC50-96h 10,9 10,6 – 11,2
Thời gian (giờ)
Tỷ lệ cá chết (%) ở các nồng độ Iprobenfos Đối chứng 10,2 mg/L 10,8 mg/L 11,4 mg/L 12,1 mg/L 12,8 mg/L 1 0 0 0 0 0 3,33 3 0 0 0 0 6,67 43,33 6 0 0 0 3,33 26,67 56,67 9 0 0 0 3,33 26,67 56,67 12 0 0 6,67 6,67 30 56,67 24 0 3,33 10 26,67 56,67 60 48 0 13,33 43,33 80 86,67 70 72 0 16,67 46,67 80 86,67 70 96 0 16,67 46,67 80 86,67 90
Căn cứ theo cách phân loại độc tính hóa chất của Koesoemadinata và Djajadirecdia (1976) thì Iprobenfos thuộc loại thuốc ít độc cho cá vì có LC50-96 giờ lớn hơn 1 mg/L. Theo phân loại của WHO thì Kisaigon 50ND chứa 50% hoạt chất Iprobenfos thì thuốc này thuộc nhóm II có độc tính trung bình và ảnh hƣởng lớn đến các loài thủy sinh vật khi phát tán ra ngoài môi trƣờng.
Giá trị LC50 – 96 giờ của các hoạt chất khác nhau đối với các loài thủy sản
thì khác nhau. Giá trị LC50 của Iprobenfos đối với cá Lóc (Channa punctata) là
14,7 mg/L ( University of Hertfordshire, 2007). Qua đó cho thấy Iprobenfos độc với
cá chép hơn cá Lóc (Channa punctata).
Giá trị LC50-96 giờ đối với cá chép của chlorpyrifos là 0,16 mg/L (Halappa and David, 2009), malathion là 0,82 mg/L, methyl parathion là 0,85 mg/L (Luciano
and Giovanna, 1990), diafuran là 1,81 mg/L (Jaqueline et al, 2008), quinalphos là
3,0 mg/L (Alam và Shafi, 1990), Diazinon là 3,66 mg/l (Đỗ Thị Thanh Hƣơng,
1997), Carbaryl là 7,85 mg/L (De Mel et al., 1979), Fenobucarb là 10,33 mg/L
(Nguyễn Trọng Hồng Phúc, 2010), Qua đó cho thấy Iprobenfos thuộc nhóm ít độc đối với cá chép, độc tính tƣơng đƣơng với Fenobucarb.
Trong canh tác lúa ở ĐBSCL, lúa thƣờng đƣợc trồng từ 2 – 3 vụ/năm. Theo nghiên cứu của Lê Huy Bá và Lâm Minh Triết (2005) cho thấy khi phun thuốc BVTV cho cây trồng thì có ít hơn 50% thuốc bám trên cây trồng, phần còn lại bay vào không khí, rơi xuống đất, nƣớc. Do đó, nếu Kisaigon 50ND (tức 1 lít Kisaigon chứa 500 g Iprobenfos) đƣợc phun trên ruộng lúa theo liều chỉ dẫn 1 – 2 lít/ha, với
mực nƣớc trên ruộng lúa là 0,1 m thì thể tích nƣớc trên ruộng = 0,1*1 ha = 1000 m3.
Giả sử khi phun Kisaigon thì có 0,5 lít rơi xuống nƣớc. Từ đó tính đƣợc nồng độ chỉ dẫn là 0,25 mg/L – 0,5 mg/L, gần bằng 4% - 5% giá trị LC50 theo kết quả thí nghiệm. So với kết quả tỷ lệ chết trong thí nghiệm thăm dò cũng nhƣ thí nghiệm LC50 thì nồng độ này chƣa đến mức làm chết cá chép. Nếu sau khi phun có mƣa thì toàn bộ thuốc có thể sẽ rửa trôi vào nƣớc. Khi đó nồng độ tăng gấp đôi và cũng ở mức 8-10% LC50-96 giờ. Tƣơng tự, nếu so với kết quả tỷ lệ chết trong thí nghiệm thăm dò cũng nhƣ thí nghiệm LC50 thì nồng độ này chƣa đến mức làm chết cá chép .
4.3 Nhạy cảm của ChE trong não cá chép với Iprobenfos 4.3.1 Các yếu tố môi trƣờng trong 96 giờ thí nghiệm 4.3.1 Các yếu tố môi trƣờng trong 96 giờ thí nghiệm
Nhiệt độ giữa các nghiệm thức trong cùng một buổi đồng nhất, chênh lệch
enzyme này càng cao (Nguyễn Văn Công và ctv., 2006c). Nhiệt độ dao động không lớn nên không ảnh hƣởng đến độc tính của Iprobenfos.
Oxy hòa tan (DO) dao động từ 4,07 – 4,43 mg/L vào buổi sáng và từ 2,81 – 3,24 mg/L. Khi DO giảm thấp thì hầu hết sinh vật sẽ gia tăng lấy oxy cho nhu cầu cơ thể. Sự gia tăng đƣợc thực hiện thông qua tăng trao đổi nƣớc qua mang, tăng hoạt động cơ quan hô hấp khí trời, tăng lƣợng hồng cầu tăng ái lực hay khả năng
gắn kết oxy với hồng cầu (Jensen et al., 1993). Hậu quả làm cho chất độc xâm nhập
vào cơ thể nhanh hơn và gây độc nhanh hơn (Hooey et al., 1991). Do đó DO trong
thí nghiệm này có thể ảnh hƣởng đến độc tính của Iprobenfos nên cần đƣợc theo dõi thƣờng xuyên.
Giá trị pH trong thí nghiệm dao động thấp buổi sáng dao động khoảng 0,26 mg/L, buổi chiều khoảng 0,12 mg/L. Theo Mayer and Ellersieck (1996) cũng xác định pH có ảnh hƣởng không đáng kể đối với độc tính của parathion cũng nhƣ thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ. Giá trị pH của thí nghiệm dao động thấp nên không ảnh hƣởng đến độc tính của Iprobenfos và đồng thời cũng nằm trong khoảng thích hợp cho cá chép. Nhìn chung các yếu tố môi trƣờng DO, nhiệt độ, pH khá đồng nhất giữa các nghiệm thức và nằm trong khoảng thích hợp cho cá chép.
Bảng 4.5: Trung bình nhiệt độ, oxy hòa tan và pH trong thí nghiệm nhạy cảm ChE
Iprob enfos (mg/L
)
DO (mg/L) Nhiệt độ (0C) pH
Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều
0 4,43 ± 0,05 3,15 ± 0,08 28,13 ± 0,16 29,5 ± 0,15 6,75 ± 0,12 6,66 ± 0,05 0,11 4,14 ± 0,1 3,24 ± 0,09 28,13 ± 0,16 29,5 ± 0,15 6,52 ± 0,06 6,54 ± 0,03 0,22 4,07 ± 0,04 3,22 ± 0,08 28,13 ± 0,16 29,5 ± 0,15 6,49 ± 0,06 6,58 ± 0,04 0,5 4,08 ± 0,09 3,22 ± 0,08 28,13 ± 0,16 29,63 ± 0,13 6,54 ± 0,05 6,62 ± 0,05 1,09 4,23 ± 0,14 2,81 ± 0,09 28,13 ± 0,16 29,5 ± 0,15 6,51 ± 0,05 6,59 ± 0,04 (Trung bình ± SE, n=12)
4.3.2 Nhạy cảm của enzyme ChE ở cá Rô đồng với Iprobenfos
Kết quả theo dõi thí nghiệm cho thấy trong khoảng 6 giờ đầu tiếp xúc với Iprobenfos, cá bơi chậm hơn, tập trung chủ yếu ở đáy bể thí nghiệm. Ở những nghiệm thức có thuốc cá gia tăng hô hấp, ít hoạt động hơn. Trong 3 giờ đầu tiếp xúc với Iprobenfos, cá tập trung ở đáy của bể thí nghiệm. Trong suốt 96 giờ thí nghiệm, nghiệm thức đối chứng không xuất hiện cá chết.
Trƣớc khi tiếp xúc với thuốc ChE của các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa (P > 0,05) có giá trị trung bình là 9,49 µM/g/phút. Sau 3 giờ tiếp xúc với Iprobenfos thì tỷ lệ ức chế ChE của các nghiệm thức so với đối chứng đều tăng, ở nồng độ thấp nhất (0,11 mg/L) là 8,2 % và ở nồng độ cao nhất (1,09 mg/L) là 21,82 % nhƣng ở các mức nồng độ này đều cho kết quả không sai khác so với đối chứng (P > 0,05). Ở thời điểm 9 giờ tỷ lệ ức chế ChE ở nồng độ 0,11 mg/L, 0,22 mg/L, 0,5 mg/L và 1,09 mg/L lần lƣợt là 24,48 %, 22,19 %, 35,74 % và 14,22 %.Ở thời điểm 24 giờ, tỷ lệ ức chế ChE ở tất cả các nghiệm thức đều tăng (P < 0,05); ở nghiệm thức 1% LC50, 2% LC50, 10% LC50 và liều chỉ dẫn cao nhất khi phun thuốc lần lƣợt là 27,58 %, 38,95 %, 34,41 % và 52,33 %. Ở thời điểm 48 giờ, tỷ lệ ức chế ChE tiếp tục tăng ở tất cả các nghiệm thức. Ở mức nồng độ cao nhất 1,09 mg/L là 62,23 %, nồng độ thấp nhất 0,11 mg/L là 22,86 %. Đến thời điểm 72 giờ thì tỷ lệ ức chế ChE vẫn tăng. Tại thời điểm 96 giờ, ở nồng độ 0,22 mg/L thì có tỷ lệ ức chế ChE là 19,16 % giảm so với thời điểm sau 24 giờ và cũng không có sai khác có ý nghĩa với đối chứng. Ở các nồng độ còn lại đều có sai khác có ý nghĩa so với đối chứng, cụ thể là nồng độ 1,09 mg/L, 0,5 mg/L, 0,11 mg/L lần lƣợt có tỷ lệ ức chế ChE là 72,7 %, 35,63 % và 36,82 %. Điều này cho thấy hoạt chất Iprobenfos gây ức chế lâu dài đối với cá chép, có thể là do Iprobenfos tồn tại lâu ngoài môi trƣờng (DT50 trong nƣớc của Iprobenfos là 7230 – 7793h (pH: 4 – 9) (Univesity of Hertfordshire, 2007)).
Hình 4.1: Tỷ lệ hoạt tính của ChE bị ức chế (%, trung bình ± SE, n =6) trong não cá chép khi tiếp xúc với Iprobenfos trong 96 giờ, các giá trị có cùng mẫu tự (a,b) khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P < 0,05; kiểm định Duncan), các giá trị có dấu * là khác biệt so với đối chứng (P < 0,05; kiểm định Dunnet) ở cùng thời gian thu mẫu
Thí nghiệm hiện tại cho thấy hoạt tính ChE ở não cá nhạy cảm với thuốc BVTV chứa hoạt chất Iprobenfos sau 96 giờ dù ở nồng độ thấp là 0,11 mg/L (1% LC50 – 96 giờ) nhƣng vẫn bị ức chế có ý nghĩa so với đối chứng. Kết quả thí nghiệm cho thấy độc tính của thuốc BVTV chứa hoạt chất Iprobenfos gây ức chế kéo dài cho ChE cá chép. Weiss (1961) nhận thấy rằng chỉ cần ức chế trên 8 % hoạt tính AchE là liều gây độc cho cá (Trích dẫn của Nguyễn Trọng Hồng Phúc, 2010).
Trong khi đó, Aprea et al., (2002) cho rằng ngƣỡng giới hạn cho phép hoạt tính
AchE bị ức chế không quá 30% so với bình thƣờng (Trích dẫn của Nguyễn Quang Trung, 2013).
Kết quả thí nghiệm hiện tại còn cho thấy mức độ ức chế hoạt tính ChE ở não tăng theo sự gia tăng của nồng độ thuốc. Hoạt tính ChE ở não bị ức chế nhiều nhất ở thời điểm 48 - 96 giờ và sau 96 giờ hoạt tính ChE ở não vẫn chƣa có biểu hiện phục hồi. Nguyễn Trọng Hồng Phúc (2010) nhận thấy rằng hoạt tính men ChE ở não của
cá chép (Cyprius carpio) tiếp xúc với thuốc trừ sâu fenobucarb (gốc carbamate) bị
ảnh hƣởng mạnh trong 96 giờ; ở nồng độ 10,3 mg/L thì cá bị ức chế đến 89,3%.