Giá trị CV% thể hiện độ chính xác của thí nghiệm. Đối với thí nghiệm
đồng ruộng ở dạng điều tra, khảo sát đạt yêu cầu về độ chính xác khi CV%<30. Kết quả tính giá trị CV% của mỗi tính trạng tương ứng với mỗi dòng ngô từ bảng 6 cho thấy đa sốđều nhỏ hơn 15% chứng tỏ các dòng có độ đồng đều khá cao về các tính trạng.
e) Xác định dòng ngô có đặc điểm nông sinh học tốt cho bước nghiên cứu tiếp theo
Năng suất cao là mục đích của bất kỳ chương trình chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng. Nhiều tác giảđã nghiên cứu mối tương quan giữa các tính trạng ở ngô và năng suất cho thấy rằng, khối lượng 1000 hạt có mối tương quan dương với năng suất (Son và cs, 2007; Zdunić và cs, 2012). Wali và cs (2012) nghiên cứu mối liên quan giữa 12 tính trạng số
lượng và năng suất đã cho kết quả năng suất có mối tương quan âm với ngày tung phần, ngày phun râu. Do đó hướng lựa chọn dòng ngô trong lai tạo theo ngày trỗ cờ và ngày phun râu không hữu ích trong mục đích nhằm cải tiến năng suất ngô. Năng suất ngô có mối tương quan dương với các tính trạng còn lại gồm: cao cây, cao đóng bắp, số hàng hạt, số hạt/hàng, đường kính bắp, % khối lượng hạt/bắp.
Từ kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học của 28 dòng ngô, đề tài xác định 12/28 dòng có đặc điểm nông sinh học tốtlà C127, C157, C175, C194, C199, C362, C604, C649, C762, C769, C781 sử dụng trong lai tạo THL cho bước nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Kết quảđánh giá đa dạng di truyền các dòng ngô.
Trong nội dung nghiên cứu của đề tài chúng tôi tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của 28 dòng ngô bằng hai phương pháp: sử dụng các đặc điểm nông sinh học và sử dụng chỉ thị phân tử SSR.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44
3.2.1. Kết quảđánh giá đa dạng di truyền các dòng ngô sử dụng đặc
điểm nông sinh học.
Đánh giá đa da di truyền dựa trên các đặc điểm nông sinh học trên đối tượng cây ngô đã được nhiều tác giả sử dụng (Khalil và cs, 2008; Ngô Hữu Tình, 1996; Mai Xuân Triệu, 1998; Beyene và cs 2005; Khuất Hữu Trung, 2009; Ranatunga và cs, 2009). Các tác giả trên sử dụng các tính trạng số
lượng hoặc các tính trạng chất lượng để phân nhóm các nguồn gen ngô nghiên cứu. Trong nghiên cứu của đề tài chúng tôi sử dụng kết hợp giữa hai tính trạng chất lượng và tính trạng số lượng để tiến hành phân tích và sử dụng phương pháp UPMGA nhằm phân nhóm ưu thế lai các dòng ngô. 30 tính trạng đề tài sử dụng gồm 21 tính trạng số lượng (chiều cao cây, chiều cao
đóng bắp, dài cờ, số nhánh cờ cấp 1, dài cổ cờ, dài lá, rộng lá, dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt, số hạt/hàng, tổng số lá, thời gian tung phấn, thời gian phun râu, ASI, thời gian sinh trưởng, khối lượng bắp, khối lượng lõi, % khối lượng hạt/bắp, khối lượng 1000 hạt, năng suất hạt) và 9 tính trạng chất lượng
được trình bày ở phụ lục 1. Trong số 9 tính trạng chất lượng được theo dõi, có hai tính trạng màu hạt và màu lõi không cho đa hình; 7 tính trạng còn lại đều cho đa hình; tính trạng màu thân thể hiện ở 2 dạng (tía và xanh), tính trạng lớp lông bẹ lá thể hiện ở 3 dạng (thưa, trung bình và rậm), tính trạng hướng lá thể hiện ở 2 dạng (đứng và ngang), tính trạng màu của mày bao phấn thể hiện
ở 3 dạng (tím nhẹ, tím, xanh), tính trạng màu râu thể hiện ở 4 dạng (xanh, hồng,tím, trắng), tính trạng màu lá thể hiện ở 4 dạng (xanh vàng, lục nhạt, xanh lục, xanh đậm), tính trạng dạng hạt thể hiện ở 3 dạng (đá, bán răng ngựa và răng ngựa).
Dựa trên đặc điểm nông sinh học đã thu thập của 28 dòng ngô, chúng tôi đã tiến hành tính hệ số tương đồng di truyền của từng cặp dòng ngô (phụ
lục 2). Trong đó hệ số tương đồng di truyền giữa cặp C766xC112 là cao nhất (0.97) và cặp C649xC140 có hệ số tương đồng thấp nhất (0.43) trung bình
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 0.68. Hệ số tương đồng di truyền của từng cặp dòng ngô được trình bày ở phụ
lục 2. Kết quả nghiên cứu của đề tài được so sánh với kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho ở bảng 7.
Bảng 7: Kết quả hệ số tương đồng di truyền của đề tài và một số nghiên cứu khác Tác giả Hệ số tương đồng Kết quả nghiên cứu của đề tài 0.43-0.97 Beyene và cs (2005) 0.32-0.9 Khuất Hữu Trung (2009) 0.13-0.52 Ranatunga và cs (2009) 0.22-0.78 (tính trạng chất lượng) So sánh hệ số tương đồng di truyền của đề tài và một số kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ tương đồng di truyền giữa các các cặp dòng ngô thuộc
đề tài khá cao. Điều này có thể là do bản chất nguồn vật liệu đề tài đã sử
dụng, các dòng ngô được chọn lựa theo đặc điểm nông sinh học cho mục đích chọn tạo giống cụ thể; vì vậy có sự giống nhau ở mức hình thái khá lớn giữa các dòng về các tính trạng số lượng và tính trạng chất lượng. Các nghiên cứu khác đã sử dụng các dòng ngô trong tập đoàn nguồn gen vì vậy có mức khác biệt lớn về các tính trạng nên hệ số tương đồng di truyền giữa các dòng ở mức hình thái cao hơn so với các dòng ngô chúng tôi đã sử dụng.
Từ kết quả hệ số tương đồng di truyền, chúng tôi tiến hành phân tích cụm cho ra sơ đồ phả hệ biểu thị mối quan hệ di truyền giữa các dòng ngô (hình 4)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46
Hình 4: Sơđồ phả hệ của 28 dòng ngô thông qua phân tích các đặc điểm hình thái, nông học
Dựa vào sơ đồ phả hệ biểu thị mối quan hệ giữa các dòng ngô và giá trị
hệ số tương đồng di truyền trung bình 0.68, chúng tôi chia 28 dòng ngô làm 5 nhóm có mức tương đồng giữa các nhóm ≤0.68. Nhóm 1 gồm 23 dòng ngô: C783, C122, C766, C762, C604, C582, C127, C194, C614, C186, C175, C362, C174, C252, C781, C769, C157, C120, C575, C182, C104, C771, C91. Nhóm 2 có 1 dòng C199. Nhóm 3 có 1 dòng C649. Nhóm 4 có 1 dòng C140. Nhóm 5 có 2 dòng C632, C759.
3.2.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền nguồn các dòng ngô sử
dụng chỉ thị phân tử SSR
Công việc đánh giá đa dạng di truyền 28 dòng ngô sử dụng chỉ thị phân tử SSR được đánh giá trong vụ Xuân 2014, song song với việc đánh giá các
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47
a) Kết quả tách chiết DNA tổng số
Đây là công việc đầu tiên trong công tác đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR và là kỹ thuật cơ bản trong công nghệ DNA, để có
được kết quả thí nghiệm tốt sau này thì chất lượng DNA tổng số của các dòng ngô phải đạt chất lượng và độ tinh sạch theo yêu cầu dùng làm khuôn cho phản ứng PCR.
Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8%.
Hình 5: Ảnh điện di DNA tổng số của 28 dòng ngôtrên gel agarose 0.8%
Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số chỉ có duy nhất một băng, không bị đứt gãy, ít tạp nhiễm protein và RNA.
Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số của 28 dòng ngô trình bày ở
bảng 8. Nồng độ DNA tổng số của 28 dòng ngô, sản phẩm DNA sau khi tách chiết thu được có nồng độ khá cao từ 220 – 590 µg/ml; độ tinh sạch đảm bảo
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48
Bảng 8: Nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số của 28 dòng ngô
TT Tên dòng OD260/ OD280 Nồng độ DNA (µg/ml) TT Tên dòng OD260/ OD280 Nồng độ DNA (µg/ml) 1 C91 1.8 360 15 C362 2.0 390 2 C104 1.8 320 16 C575 1.9 380 3 C112 1.9 370 17 C582 1.8 470 4 C120 2.0 280 18 C604 1.95 420 5 C127 2.0 490 19 C614 2.0 460 6 C140 1.8 240 20 C632 2.0 500 7 C157 1.9 470 21 C649 2.0 390 8 C174 1.85 520 22 C759 2.0 400 9 C175 1.9 580 23 C762 1.85 380 10 C182 2.0 590 24 C771 1.8 510 11 C186 1.95 220 25 C766 1.9 500 12 C194 1.8 520 26 C769 1.9 480 13 C199 1.8 530 27 C781 1.8 410 14 C252 1.9 460 28 C783 1.9 440 b) Kết quả phân tích băng DNA đa hình và mức độ đa hình của từng locus SSR.
DNA tổng số của 28 dòng ngô sau khi tách chiết được pha loãng đến nồng độ 10 µg/µl để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với 27 mồi SSR thuộc hai nhóm mồi Phi (22 mồi) và Umc (5 mồi). Sau đó sản phẩm PCR
được điện di trên gel polyacrylamide với marker chuẩn là ΦX174/HinfI. Hình
ảnh điện di của một số mồi như sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49
Hình 6.2: Ảnh điện di sản phẩm SSR-PCR với mồi Phi101049
Hình 6.3: Ảnh điện di sản phẩm SSR-PCR với mồi Phi227562
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 Sau khi chạy điện di và phân tích kết quả của 27 mồi SSR cho thấy các băng DNA đa hình xuất hiện ở 2 trạng thái khác nhau, 20 mồi SSR thể hiện băng DNA đa hình ở trạng thái một băng duy nhất và 7 mồi SSR thể hiện băng DNA đa hình ở trạng thái băng kép là Umc1139, Phi076, Phi448880, Phi213984, Phi062, Umc1143, Phi227562. Kích thước sản phẩm PCR của 27 mồi SSR khi so sánh với marker chuẩnΦX174/HinfI cho thấy dao động trong khoảng marker có kích thước từ 66.66 bp đến 413bp. Khi so sánh trạng thái và kích thước băng DNA đa hình với tài liệu hướng dẫn phân tích đa dạng di truyền với các mồi SSR được phát triển bởi ABIONET-CIMMYT thể hiện kết quả tương tự nhau.
Thống kê kết quả phân tích bản gel điện di cho thấy các mồi SSR phân thành 2 nhóm:
- Mồi SSR với 1 allen đặc hiệu (Phi062, Phi072, Umc1109, Umc1143, Phi229852, Umc1136, Phi087, Phi083, Phi029, Phi96342, Phi448880, Phi108411), có nghĩa là trên bản gel chỉ xuất hiện duy nhất băng DNA đa hình, không xuất hiện băng DNA phụ. Đây là kiểu xuất hiện điển hình của một chỉ thị SSR.
-Mồi SSR với nhiều băng DNA (các chỉ thị còn lại), tuy nhiên vẫn dễ
dàng nhận biết vị trí băng DNA đa hình giữa các dòng ngô. Trong trường hợp này một cặp mồi có thể có một đến vài locus nằm trên cùng hoặc không cùng nhiễm sắc thể trong hệ gen dẫn đến xuất hiện nhiều băng DNA. Ngoài locus mang băng DNA đa hình thì các locus khác có khuếch đại băng DNA nhưng không cho đa hình giữa các dòng ngô, vì vậy những locus này không có ý nghĩa trong đánh giá đa dạng di truyền
27 mồi SSR khuếch đại tổng số 99 allen, trung bình 3.66 allen/locus. Ở
một vài locus SSR có những mẫu DNA tổng số của một vài dòng ngô không có băng DNA sản phẩm PCR trong khi ảnh điện di cho thấy có DNA khuôn,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 có thể những mẫu DNA tổng số của các dòng này không có vị trí bắt cặp của mồi trong genome do bản chất nguồn vật liệu.
Bảng 9: Thống kê số alen và hệ số PIC của 27 mồi SSR
TT Primer NI Tổng số allen PIC N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 1 Phi 101049 1 3 5 6 1 4 1 5 2 9 0.85 2 Umc1399 9 11 1 4 4 0.65 3 Phi 076 9 4 4 8 4 0.72 4 Phi 053 7 2 15 4 2 5 0.67 5 Phi 078 2 4 11 7 4 0.87 6 Phi 227562 2 3 11 4 6 5 0.72 7 Phi 96342 22 1 5 3 0.35 8 Phi 374118 5 13 3 3 6 5 0.73 9 Phi 063 18 8 1 3 0.47 10 Phi 072 1 16 10 5 4 0.63 11 Phi 062 26 2 2 0.13 12 Phi 448880 21 4 2 3 0.37 13 Phi 213984 26 1 2 0.07 14 Phi 299852 1 10 8 9 4 0.69 15 Phi 084 3 19 4 3 0.43 16 Phi 109188 1 16 9 3 0.5 17 Umc1109 1 1 24 3 0.14 18 Phi 065 6 1 20 3 0.4 19 umc 1196 15 5 4 2 4 0.6 20 umc 1143 8 4 8 7 4 0.74 21 Phi 108411 5 16 2 0.36 22 Phi 100175 1 1 20 3 0.17 23 Phi 423796 1 24 3 1 4 0.3 24 Phi 102228 8 2 26 3 0.43 25 Phi 029 8 5 13 3 0.62 26 Phi 083 15 8 2 3 0.53 27 Umc 1136 12 5 7 1 4 0.65 Trung bình 99 0.51 Chú thích: NI: Số lần xuất hiện của allen thứ I
So sánh với số liệu của ABIONET-CIMMYT công bố về số allen thể
hiện tương ứng với mỗi mồi SSR cho thấy có 11 mồi (Phi101049, Phi076, Phi227562, Phi062, Phi448880, Phi213984, Phi084, Phi065, umc1196, Phi423796, Phi102228) khuếch đại số allen tương ứng với số allen trên quần thể ngô mà ABIONET-CIMMYT sử dụng. Các mồi còn lại khuếch đại số
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52
Bảng 10: So sánh kết quả số allen/mồi SSR của đề tài và của ABIONET- CIMMYT
Primer allen/mKết quồi cảủ sa ốđề tài cáo bSố allen/mởi ABIONET-CIMMYT ồi SSR được báo
Phi 101049 9 9 Umc1399 4 5 Phi 076 4 4 Phi 053 5 6 Phi 078 4 9 Phi 227562 5 5 Phi 96342 3 5 Phi 374118 5 6 Phi 063 3 6 Phi 072 4 6 Phi 062 2 2 Phi 448880 3 3 Phi 213984 2 2 Phi 299852 4 10 Phi 084 3 3 Phi 109188 3 7 Umc1109 3 4 Phi 065 3 3 umc 1196 4 4 umc 1143 4 8 Phi 108411 2 3 Phi 100175 3 8 Phi 423796 4 4 Phi 102228 3 3 Phi 029 3 6 Phi 083 3 5 Umc 1136 4 6 Tổng số alen 99 142
Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) là chỉ số thông tin đa hình của mồi, được coi là thước đo tính đa dạng di truyền ở từng locus SSR (Smith và cs, 1997). Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng ngô với 27 mồi SSR ở (bảng 9) cho thấy giá trị PIC thay đổi từ 0.07 (Phi 213984) đến 0.87 (Phi 078). Giá trị PIC trung bình của 27 mồi SSR là 0.51, thấp hơn so
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 với kết quả khi tính hệ số PIC trung bình của 27 mồi SSR theo nghiên cứu dựa trên quần thể ngô của ABIONET_CIMMYT là 0.59. Theo Struss D. và Plieske J. đa hình di truyền cũng bị ảnh hưởng bởi mức độ đa hình của mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu, do đó việc lựa chọn mồi SSR với tính đa hình cao cũng sẽ góp phần làm tăng giá trị PIC (Struss và Plieske 1998). Hệ số PIC cao cho thấy sựđa dạng di truyền giữa các dòng ngô nghiên cứu càng lớn, khi
đó tiềm năng khai thác ưu thế lai càng dễ dàng hơn (Marcia B, 2009).
c) Kết quả đánh giá độ thuần di truyền của các dòng ngô và tỷ lệ
khuyết số liệu.
Trong chương trình tạo giống ngô lai, xác định độ thuần di truyền của nguồn vật liệu là công việc quan trọng để tạo ra các tổ hợp lai ưu tú, đạt độổn
định cao. Nhưng vì ngô là cây giao phấn điển hình nên việc tạo ra dòng thuần có tỷ lệđồng hợp tử 100% là điều khó khăn trong công tác tạo dòng. Chính vì vậy, các dòng có tỷ lệđồng hơp tử lớn hơn 80% (tỷ lệ dị hợp tử <20%) có thể được dùng làm nguyên liệu khởi đầu cho công tác lai tạo giống ngô (ABIONET-CIMMYT, 2004).
Thống kê kết quả điện di sản phẩm PCR, căn cứ vào sự xuất hiện và không xuất hiện băng DNA trên gel điện di theo từng locus, nếu xuất hiện 1 băng DNA là đồng hợp tử, 2 băng DNA là dị hợp tử. Tỷ lệ dị hợp tử của mỗi mẫu H% được tính bằng tỷ số giữa số locus (mồi) dị hợp tử ở mẫu đó trên tổng số mồi sử dụng có băng DNA đa hình. Kết quả tỷ lệ dị hợp tử của từng dòng ngô trình bày ở (bảng 10). Tất cả 28 dòng ngô đều có tỷ lệ dị hợp tử
H%<20% vì vậy các dòng ngô này đạt yêu cầu để lai tạo giống ngô lai.