Phương pháp thu mẫu
Thu mẫu cá khoẻ và cá bệnh mủ gan ở 25 ao nuôi khác nhau ở các giai đoạn khác nhau: chưa nhiễm bệnh, đang nhiễm bệnh, 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng sau nhiễm bệnh. Ghi nhận tình hình hình nuôi cá ở nông hộ: nguồn giống, mật độ, thời gian thả giống, nguồn nước, thuốc và hóa chất sử dụng, dịch bệnh... Mỗi ao thu từ 5 đến 10 con. Bên cạnh đó, trong số 18 ao cá bệnh đã thu chọn 4 ao để thu mẫu theo dõi định kỳ hàng tháng/lần trong vòng 3 tháng. Trong 7 ao cá khỏe có 4 ao đã từng xuất hiện bệnh mủ gan, 3 ao chưa từng xảy ra bệnh, 3 ao cá khỏe này cũng được thu mẫu định kỳ hàng tháng/lần trong vòng 3 tháng. Cá thu được từ các ao nuôi có trọng lượng từ 30 đến 550g.
Thu mẫu máu
Sử dụng benzocain (Merck) nồng độ 100 ppm để gây mê cá trong 1 – 2 phút. Vệ sinh vùng gần cuống đuôi của cá. Dùng kim tiêm 1ml châm nhẹ vào phần cuống đuôi cho để lấy máu từ động mạch chủ ở cột sống (Houston,1990). Cho máu vào ống eppendorf 1,5ml và để yên 2 – 3 giờ trong ngăn mát tủ lạnh, sau đó ly tâm 6.000 vòng/phút trong 5 phút (Phạm Công Thành, 2010). Rút lấy phần huyết thanh phía trên cho vào ống eppendorf khác rồi đem xác định hàm lượng kháng thể hoặc trữ lạnh.
Hình 3.1 A) Phương pháp rút máu cá tra; B) Máu cá sau khi ly tâm
Kiểm tra vi khuẩn
Sau khi thu mẫu máu tiến hành cấy vi sinh ở các cơ quan: gan, thận, tỳ tạng, ủ ở 28,5ºC trong vòng 48 giờ rồi test các chỉ tiêu sinh lý-sinh hóa vi khuẩn (phụ lục 1). Bên cạnh đó còn sử dụng phản ứng với anti-sera để xác định nhanh tác nhân gây bệnh.
Huyết thanh
Phương pháp bất hoạt vi khuẩn bằng formaline
Vi khuẩn sau khi được nuôi tăng sinh được bất hoạt bằng formaline (37%). Xác vi khuẩn được rửa sạch formaline bằng nước muối sinh lý và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh hoặc ở -20ºC.
Phản ứng vi ngưng kết kháng nguyên kháng thể
Phản ứng này thường được thực hiện trên microplate 96 giếng theo phương pháp vi ngưng kết kháng nguyên- kháng thể của Roberson (1990). Hút 25 μL nước muối sinh lý cho vào các giếng được đánh số từ 2 đến 12.
Cho 25μl huyết thanh vào giếng số 1 và 2. Từ giếng số 2 trở đi pha loãng huyết thanh bằng nước muối sinh lý với nồng độ pha loãng bằng ½. Cuối cùng cho 25μl huyền dịch xác vi khuẩn vào các giếng rồi trộn đều. Để yên 4 – 5 giờ ở nhiệt độ phòng rồi đọc kết quả.
Mổi microplate có sử dụng 1 đối chứng dương và 1 đối chứng âm.
Cách đọc kết quả:
Dương tính (+): Đáy giếng tạo thành một lớp ngưng kết trải rộng.
Âm tính (-): Ở đáy giếng chỉ có một chấm tròn nhỏ màu trắng.
Hình 3.2 Cách đọc kết quả