Kháng nguyên A, B, H, Lea, Leb, Lex, Ley cĩ trong mẫu nước bọt sẽ được xác định bằng kỹ thu t ELISA. Mẫu nước bọt được biến tính ở 1000C trong 10 phút sau đĩ pha lỗng 1:1.000 trong dung dịch PBS 1X. 100 l mẫu sau khi pha lỗng được sử dụng để phủ bản 96 giếng (Maxisorp, Nunc) qua đêm ở 40C. Mỗi đĩa 96 giếng đều sử dụng các chứng dương, chứng âm là mẫu nước bọt chứa các kiểu hình đã biết của các loại kháng nguyên nhĩm máu. Sau thời gian ủ (16-18 tiếng ở 40C), đĩa 96 giếng được phủ 200 l dung dịch PBS 1X, 5% skim milk và ủ ở 37o
C trong 1 giờ. Loại bỏ dung dịch trong giếng, thêm 100 l dung dịch kháng thể đơn dịng đặc hiệu kháng nguyên A, B, H, Lea
, Leb, Lex, Ley (Covance Princeton) vào các giếng, ủ đĩa 96 giếng ở 37oC trong 1 giờ. Sau khi loại bỏ dung dịch kháng thể đơn dịng trong các giếng, 100 l dung dịch cộng hợp IgG, IgM, IgG3 kháng chuột gắn peroxidase được thêm vào các giếng, tiếp tục ủ đĩa ở 37oC trong 1 giờ. Sau thời gian ủ, cộng hợp được loại bỏ và thêm 100 l phức hệ cơ chất TMB-H2O2 (KPL) vào các giếng. Sau 3 đến 5 phút phản ứng được dừng bằng dung dịch HCl 1N và đo độ hấp phụ quang (OD) ở bước sĩng 450 nm/620 nm. Những mẫu cĩ giá trị OD450
nm/620 nm ≥ 0.1 (giá trị ngưỡng) là những mẫu cĩ chứa kháng nguyên nhĩm máu
ứng dương tính trong kỹ thu t ELISA, kiểu hình Lea-
, Leb-, Lex- và Ley- được đánh giá khi khơng phát hiện được kháng nguyên tương ứng. Nhĩm A, B hoặc AB được đánh giá khi kháng nguyên A,B hoặc cả 2 tương ứng được phát hiện. Nhĩm O được kết lu n khi khơng phát hiện được cả kháng nguyên A và B. Mẫu khơng xác định được nhĩm máu bao gồm mẫu khơng phát hiện đồng thời kháng nguyên Lewis ab, Lewis xy và AB.
2.5. Xử lý số l ệu
Các số liệu thu th p được xử lý bằng phương pháp thống kê y học và chương trình Epi info 7, SPSS.
Xử lý trìn tự nucleot de
+ Sau khi nh n được các trình tự nucleotide từ Macrogen, các trình tự thơ được xử lý bằng phần mềm Bioedit 7.0 và Mega 5.0.
+ Kiểu gen của NoV được xác định bằng cách đăng tải trình tự nucleotide lên trang web http://www.rivm.nl/mpf/NoV/typingtool
+ Kiểu gen của FUT-2 tại các vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 được xác định từ phân tích đỉnh sĩng tại các vị trí này bằng phần mềm Bioedit 7.Các trình tự được sửa đổi thủ cơng để phát hiện vị trí dị hợp tử. Vị trí đa hình cho tất cả các trình tự được gửi để tính tốn tỷ lệ đột biến ở vị trí C357T, A385T, G428A, C571T, C628T, 685delTGG, G849A và dự đốn mối quan hệ giữa các đột biến này và độ nhạy cảm của NoV.
SƠ ĐỒ TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Hìn 2.2. S đồ tĩm tắt nộ dun n ên cứu
Phát hiện ARN trong mẫu phân của NoV bằng kỹ thu t real time- RT PCR
Xác định NoV genotype bằng khuếch đại vùng gen C và giải trình tự.
Xác định tỷ lệ nhiễm NoV và kiểu gen của các
chủng NoV ở trẻ khỏe mạnh
Tách ADN từ mẫu niêm mạc miệng của
trẻ khỏe mạnh
Xác định các kiểu SNP trên gen FUT2 và giải
trình tự
Đánh giá mối liên quan giữa tính cảm nhiễm NoV và kiểu gen FUT2
Phát hiện kháng nguyên trong mẫu nước bọt bằng
kỹ thu t ELISA
Đánh giá mối liên quan giữa kiểu hình của kháng
nguyên HBGA với tính cảm nhiễm NoV
MỤC TIÊU 3
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tỷ lệ l u àn của NoV ở trẻ k ơn tr ệu c ứn tạ tr ờn mầm non ở Hà Nam
Đào thải vi sinh v t từ cơ thể khi khơng cĩ triệu chứng tiêu chảy là một hiện tượng phổ biến đối với nhiều tác nhân gây bệnh đường ruột, trong đĩ cĩ NoV [57]. Trong trường hợp khác, một số tác nhân gây ra các triệu chứng tiêu chảy và tiếp tục được thải ra trong nhiều tuần sau khi hết triệu chứng. Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành điều tra tỷ lệ lưu hành của NoV trong số các trẻ khơng cĩ triệu chứng tiêu chảy. Trẻ trong độ tuổi nhà trẻ được lấy mẫu phân để theo dõi 1 lần/tháng. Sau 15 tháng từ tháng 3/2014 đến hết tháng 05/2015, 694 mẫu phân thu th p được từ 183 trẻ khơng cĩ triệu chứng tiêu chảy (trung bình 3,8 mẫu/trẻ) trong tổng số 230 trẻ được theo dõi (cĩ 47 trẻ khơng cĩ mẫu phân).
Trong số mẫu thu th p được, 103 (14,8%) mẫu dương tính với NoV, 29 mẫu dương tính với GI và 74 mẫu dương tính với GII (bảng 3.1). Trong đĩ, tháng 3, tháng 4, tháng 12 năm 2014 và tháng 4 năm 2015 là 4 tháng cĩ tỷ lệ nhiễm NoV cao nhất (từ 22,2- 51,1%). Trong khi đĩ, trong năm 2014-2015, tỷ lệ nhiễm NoV ở tháng 7, tháng 8, tháng 11 năm 2014 và tháng 3 năm 2015 tỷ lệ nhiễm NoV lại rất thấp (từ 2,0-2,4%) (hình 3.1). Kết quả trên cho thấy, NoV cĩ xu hướng lây nhiễm cao vào khoảng tháng 3, tháng 4. Từ đĩ cĩ thể thấy, tính chất gây bệnh của virus này ở thời kỳ giao mùa giữa mùa xuân và hè tương đối rõ ràng nên rất dễ nh n biết để phịng tránh bệnh kịp thời cho trẻ.
Bản 3.1. Đặc đ ểm c ủn NoV ở trẻ k ỏe mạn tạ n à trẻ Hà Nam T ờ gian Tháng 3/2014 Tháng 4/2014 Tháng 5/2014 Tháng 6/2014 Tháng 7/2014 Tháng 8/2014 Tháng 9/2014 Tháng 10/2014 Tháng 11/2014 Tháng 12/2014 Tháng 01/2015 Tháng 02/2015 Tháng 03/2015 Tháng 04/2015 Tháng 05/2015 Tổn
GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII GI GII
D n tính 20 4 3 15 1 2 0 2 1 0 0 1 0 9 1 3 0 1 2 14 1 5 0 3 0 1 0 12 0 2 GI: 29 GII: 74 % 51,1 41,9 6,5 5,3 2,1 2,4 20,9 9,1 2,2 36,7 11,1 6,1 2,0 22,2 4,7 Tổn 47 43 46 38 48 41 43 44 45 49 54 49 50 54 43 694
Hiện nay, đã cĩ rất nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử các trường hợp lây nhiễm với tác nhân tiêu chảy nĩi chung và NoVnĩi riêng trong mơi trường bệnh viện và phịng khám ngoại trú. Tuy nhiên, khơng cĩ nhiều nghiên cứu về tình trạng nhiễm virus này trong điều kiện bán trú như trường mầm non. Tỷ lệ 14,8% mẫu dương tính với NoV trong nghiên cứu này nằm trong khoảng phát hiện (10-30%) cơng bố trong các nghiên cứu ở nhà trẻ tại Brazil, Hungary, Hà Lan và Hoa Kỳ [64], [95], [82], [34], [31]. Trong khi đĩ, một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm NoV ở trẻ em dưới 5 tuổi nh p viện do viêm dạ dày ruột cấp tính tại Bệnh viện Nhi Thái Bình (từ tháng 9/2010 đến tháng 8/2011) khá cao đạt 32,8% [13]. Tương tự, tỷ lệ nhiễm NoV ở trẻ em dưới 5 tuổi mắc tiêu chảy ở bệnh viện đa khoa Hà Nam là 33,5% từ tháng 10/2012 đến hết tháng 10/2013 [12]. Điều đĩ cho thấy nhiễm NoV khơng triệu chứng xảy ra khá thường xuyên, với tỷ lệ tương đương với nhiễm virus cĩ triệu chứng.
3.2. B ến độn enotype của NoV l u àn ở trẻ k ơn tr ệu c ứn tạ tr ờn mầm non ở Hà Nam
Trong nghiên cứu này, 694 mẫu phân thu th p được từ 183 trẻ (trung bình 3,8 mẫu/trẻ) trong tổng số 230 trẻ được theo dõi. Trong 694 mẫu phân, cĩ 72 trẻ (39,3%) dương tính với ít nhất một lần trong suốt thời gian nghiên cứu. Phần lớn trẻ chỉ bị nhiễm 1 lần trong suốt thời gian nghiên cứu, cũng cĩ những trẻ bị nhiễm 2 lần, 3 lần và chỉ cĩ 1 trẻ bị nhiễm 4 lần trong suốt thời gian nghiên cứu. Trong số 183 trẻ cĩ mẫu phân, cĩ 2 trẻ được phát hiện nhiễm NoV GI và GII ở hai lần lấy mẫu liên tiếp trong 2 tháng. Điều này phù hợp với những quan sát trước đây về việc các chủng NoV thuộc nhĩm gen khác nhau khơng cĩ khả năng bảo vệ chéo. Hai trẻ dương tính với NoV thuộc cùng 1 genotype ở 2 mẫu thu th p liên tiếp trong 2 tháng với giá trị Ct khác nhau, cho thấy khả năng duy trì lâu dài của virus này ở trẻ (Bảng 3.2).
Bản 3.2. Tỷ lệ n ễm NoV ở trẻ k ỏe mạn Số trẻ Số lần d n tín vớ NoV
0 1 2 3 4 Tổn
N 111 58 8 5 1 183
% 60,7 31,7 4,4 2,7 0,5 100
Mẫu phân dương tính với NoV được tìm thấy trong 12 tháng so với tổng số 15 tháng theo dõi. Genogroup G.I và G.II đều được phát hiện trong quần thể này. Đặc biệt, 16 trường hợp GI và 15 trường hợp GII được phát hiện tương ứng trong tháng 3 và tháng 4 năm 2014 (bảng 3.3). Trong nghiên cứu này, cĩ 10 kiểu gen NoV khác nhau được phát hiện trong 93 mẫu dương tính trong 15 tháng nghiên cứu bao gồm GI.2, GI.6, GII.2, GII.3, GII.4, GII.6, GII.7, GII.13, GII.15 và GII.17. Đặc biệt, trong nghiên cứu này các gen GII.17 và GII.15 lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2 và bảng 3.3 dưới đây. Điều khá thú vị khác là cĩ đến 4 kiểu gen được tìm thấy trong một tháng và một số trẻ nhiễm cùng 1 chủng lại thuộc các lớp khác nhau của nhà trẻ, cách nhau 3-5 km. Điều này cho thấy, cĩ nhiều nguồn gây bệnh khác nhau mà các em được tiếp xúc. Hay nĩi cách khác, tại cùng thời điểm, trẻ thuộc cùng 1 lớp/trường cĩ thể bị nhiễm với các genogroups khác nhau (GI và GII) hay genotypes khác nhau của GI hoặc GII.
Bản 3.3. Các enotypes NoV p át ện ở trẻ k ỏe mạn tạ n à trẻ Hà Nam (T3/2014 - T5/2015) Genotypes /số mẫu Số mẫu àn t án 3/2014 4/2014 5/2014 6/2014 7/2014 8/2014 9/2014 10/2014 11/2014 12/2014 1/2015 2/2015 3/2015 4/2015 5/2015 GI.2 13 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 GI.6 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 GII.2 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 GII.3 1 4 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 GII.4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 GII.6 1 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 GII.7 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 2 0 2 0 GII.13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 GII.15 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 2 0 GII.17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 4 2 1 1 0 P-GI (*) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P-G2 (**) 1 5 0 0 0 0 2 0 0 1 0 1 0 0 1
Chú thích: (*) P-GI: mẫu dương tính với GI nhưng khơng xác định được genotypes (**) P-GII: mẫu dương tính với GII nhưng khơng xác định được genotypes.
Hìn 3.2. Tỷ lệ l u àn enotypes NoV ở trẻ k ỏe mạn tạ n à trẻ Hà Nam
Chú thích:+ P-GI: genogroups GI khơng xác định được genotypes + P-GII: genogroups GII khơng xác định được genotypes.
Từ các kết quả trên cho thấy, sự đa dạng các genotype NoV trong quần thể trẻ khỏe mạnh này cao hơn so với quần thể trẻ mắc tiêu chảy phải nh p viện. Điều này được minh chứng rất rõ qua một số nghiên cứu trong nước cụ thể như sau: Trong một nghiên cứu của Nguyễn Vân Trang và cộng sự (2012) về một số tác nhân gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em tại bệnh viện Nhi Thái Bình năm 2010-2011 đã cơng bố cho thấy, các chủng NoV phổ biến ở miền Bắc bao gồm GI.8, GII.3, GII.4, GII.13. Trong khi đĩ, các genotype NoV lưu hành ở miền Nam đa dạng hơn với việc thêm nhiều type thuộc nhĩm gen GI và GII như GI.3, GI.4, GI.5, GII.6, GII.9 và GII.12 [13]. Cũng trong một nghiên cứu khác của Nguyễn Vân Trang và Đình Thoảng (2014) tại bệnh viện đa khoa tỉnh Hà Nam cho thấy, trong năm 2013 trên 660 trẻ mắc tiêu chảy cấp nh p viện cho kết quả các chủng lưu hành chủ yếu là GII.4, GII.3, một phần nhỏ là GII.6, GII.3 và GI.4 [12]. Sự xuất hiện của chủng GI.2 và GI.6 ở trẻ khỏe mạnh khá thú vị vì những chủng này chưa xuất hiện trong các nghiên cứu ở miền Bắc từ năm 2007 đến nay, điều đĩ cho thấy sự phong phú chủng loại của NoV lưu hành ở trẻ khỏe mạnh. Sự xuất hiện của chủng GII.17 bắt đầu từ
tháng 12 năm 2014 phù hợp với sự xuất hiện của chủng này trên thế giới. Từ tháng 12/2014 đến tháng 3/2015, chủng GII.17 được xem là nguyên nhân chính gây ra bùng phát dịch ở Nh t Bản [67].Cũng vào thời điểm đĩ, mùa đơng 2014-2015, các kết quả phân tích đã chỉ ra rằng, 82% các vụ bùng phát dịch xảy ra trên địa bản tỉnh Quảng Đơng- Trung Quốc là do chủng NoV GII.17 [63].
Để làm rõ hơn mối tương quan giữa các genotypes của Việt Nam so với các nước châu Á chúng tơi đã tiến hành phân tích trình tự một đoạn 300 nucleotide vùng capsid của các mẫu trên từ đĩ xây dựng cây phát sinh chủng lồi:
20143962P-GII.17 20143951P-GII.17 20143991P-GII.17 20143985P-GII.17 20143981P-GII.17 20143959P-GII.17 20143993P-GII.17 20143988P-GII.17 KT633386.1|NV GII.17/CHN/2014 20143975P-GII.17 20143992P-GII.17 KM268107.1|NV GII.4/Hong_Kong/2014 20155286P-GII.4 KR107717.1|NV_GII.6/SD8707/2013 20143609P-GII.6 20143672P-GII.6 20143661P-GII.6 KR107694.1|NV_GII.3/SD1605/2013 20143888P-GII.3 20143679P-GII.3 20143655P-GII.3 20143605P-GII.3 20143664P-GII.3 KP864108.1|NV GII.2 GII.2/CHN/2014 20143880P-GII.2 20143622P-GI.6 20143632P-GI.6 20143619P-GI.6 KR107922.1|NV_GI.6/SD1508/2013 KR107934.1|NV_GI.2/SD7506/2013 20143643P-GI.2 20143634P-GI.2 20143627P-GI.2 20143626P-GI.2 20143629P-GI.2 20143618P-GI.2 20155210P-GII.15 20155207P-GII.15 KR074189.1|NV GII.P15-GII.15/2011 KR107723.1|NV GII.13/2013 20145212P-GII.13 20145245P-GII.13 20155248P-GII.13 20155234P-GII.13 20155229P-GII.13 20155242P-GII.13 AF472509.1|Outgroup 99 99 75 99 52 99 81 92 99 99 99 99 80 99 99 86 99 99
Hìn 3.3. Cây p át s n c ủn lồ dựa trên đoạn en vùn caps d của các c ủn NoV p át ện tron n ên cứu này
được phát hiện ở Hàn Quốc năm 2011. Từ đĩ cho thấy, chủng này đã xuất hiện khá lâu trên thế giới nhưng chỉ mới phát hiện ở Việt Nam vào cuối năm 2014. Điều này cho thấy, khả năng tồn tại lâu dài của chủng này theo thời gian. Khác với chủng GII.15, chủng GII.17 cĩ quan hệ gần gũi với các chủng GII.17 ở Trung Quốc năm 2014. Sự xuất hiện của chủng GII.17 ở Việt Nam cũng cùng thời điểm xuất hiện của chủng này trên thế giới. Tương tự, chủng GI.2, GI.6, GII.6 và GII.13 cũng cĩ quan hệ gần gũi với các chủng GI.2, GI.6, GII.6 và GII.13 ở Hàn Quốc năm 2013. Từ đĩ cho thấy, các chủng NoV phát hiện ở Việt Nam cĩ mối quan hệ m t thiết với các chủng NoV ở Châu Á, đặc biệt là khu vực Đơng Bắc Á.
Một số điều cần bàn lu n nữa là cĩ đến 4 kiểu gen được tìm thấy trong một tháng và một số trẻ nhiễm cùng 1 chủng lại thuộc các lớp khác nhau của nhà trẻ, cách nhau 3-5 km. Điều này được thể hiện rõ ở bảng 3.4.
Bản 3.4. Đặc đ ểm enotypes NoV ở trẻ k ỏe mạn tạ một số n à trẻ ở Hà Nam vào một số t án k ác n au
T ờ
gian Genotypes
N à trẻ CG N à trẻ KK
Tổn
Cơ D Cơ Hu Cơ V Cơ
Ha Cơ Hg Cơ O Cơ Q
3/2014 GI.2 4 5 0 0 3 0 1 13
4/2014 GI.6 0 0 1 0 1 0 1 3
12/2014 GII.17 4 3 3 0 1 1 0 12
Từ bảng 3.6 cho thấy, vào tháng 4 năm 2014, số trẻ nhiễm genotype GI.2 ở lớp cơ D và cơ Hu ở nhà trẻ CG tương ứng là 4 và 5 trẻ. Cùng thời điểm đĩ số trẻ nhiễm genotype GI.2 ở lớp cơ Hg và cơ Q ở nhà trẻ KK lần lượt là 3 và 1 trẻ. Tương tự với genogroups GII trong tháng 12, số trẻ nhiễm genotype GII.17 ở lớp cơ D, cơ Hu và cơ V ở nhà trẻ CG tương ứng là 4, 3, 3 trẻ. Cịn ở nhà KK, số trẻ nhiễm genotype GII.17 ở lớp cơ Hg và cơ O tương ứng là 1,1 trẻ. Những kết quả trên cho thấy, những đứa trẻ trong cùng 1 lớp đã lây nhiễm cho nhau. Đặc biệt, sự tồn tại