3. ðỐ IT ƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3. Phương pháp lấy mẫu và ñế m số lượng vi khuẩn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………
32
sau khi chó mới thải phân. Mẫu phân ñược chứa trong lọ thủy tinh vô trùng. Mẫu phân chó bị tiêu chảy cấp tính thì lấy ngay trong ngày ñầu khi chó bắt ñầu bị tiêu chảy, chưa ñiều trị bằng kháng sinh. Nếu chó bị tiêu chảy ở thể mạn tính thì lấy phân của những chó mắc bệnh kéo dài từ ngày thứ 10 trở ñi.
– Phương pháp xử lý mẫu:
+ Mẫu lấy về chưa kịp xử lý sẽ ñược bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC.
+ Xử lý mẫu: mẫu lấy về cấy chuyển vào môi trường nước thịt, ñặt trong tủ ấm 37oC/24h. Sau ñó dùng que cấy vô trùng chuyển sang các loại môi trường phân lập.
– Phương pháp ñếm số lượng vi khuẩn
Có hai phương pháp ñếm số lượng tế bào vi khuẩn:
– Phương pháp ñếm trực tiếp bằng buồng ñếm hồng cầu. – Phương pháp ñếm gián tiếp trên ñĩa thạch
• Phương pháp ñếm bằng buồng ñếm hồng cầu
Phương pháp này cho biết cả số vi khuẩn sống và chết trong một canh trùng. Trước khi ñếm cần chuẩn bị:
+ Pha loãng canh trùng: tùy theo số lượng vi khuẩn nhiều hay ít mà pha loãng thành các hệ số 10,100, 1000, 10000.
+ Dùng buồng ñếm hồng cầu có khắc 0,mm10 x 1/ 400 mm2 + ðậy lá kính mỏng lên chỗ có khắc ở giữa buồng ñếm.
+ ðưa buồng ñếm lên kính hiển vi, tìm những ô vuông nhỏ trong buồng ñếm bằng vật kính số 8.
+ ðể yên buồng ñếm, xoay vật kính ra, dùng ống hút Paster hút canh trùng ñã pha loãng và nhỏ vào khoảng giưa kính với buồng ñếm. ðể yên vài phút nếu không thấy có bọt khí ở khu vực buồng ñếm, thì có thể bắt ñầu ñếm.
+ Xoay vật kính vào, tùy theo vi khuẩn loại nhỏ hay to mà dùng các vật kính số x 40 hay số x 8.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………
33
+ Vi khuẩn hiện lên trong buồng ñếm như những chấm ñen hoặc trong sáng, có chuyển ñộng phân tử, ñếm lần lượt số vi khuẩn trong 16 ô vuông nhỏ của 1 ô vuông to và ñếm tất cả 5 ô vuông to tức là ñếm 80 ô vuông nhỏ.
Cách tính: lấy tổng số vi khuẩn ñến ñược trong 80 ô vuông con, chia cho 80 ñể tính số vi khuẩn bình quân ñếm ñược trong 1 ô vuông nhỏ. Diện tích phần kính có khắc là 1mm2, trong ñó có tất cả 25 ô vuông to, mỗi ô vuông to có 16 ô vuông nhỏ như vậy có tất cả 400 ô vuông nhỏ. Vậy diện tích ô vuông nhỏ ta ñếm là 1/400mm2. Khoảng cách của kính có khắc ñến kính mỏng là 0,1mm. Như vậy số tết bào ñếm ñược trong 1 ô vuông nhỏ chính là số tế bào có trong 1/4000mm3canh trùng. Do ñó, muốn tính số lượng tế bào vi khuẩn trong 1ml canh trùng thì nhân nó với 1000. Nếu canh trùng pha loãng với hệ số bao nhiêu thì lại nhân với hệ số pha loãng ñó.
• Phương pháp ñếm ñĩa thạch
Dùng phương pháp này chỉ cho biết số vi khuẩn sống trong môi trường. Số lượng vi khuẩn ñược tính gián tiếp theo một công thức tính dựa trên số khuẩn lạc ñếm ñược khi cấy chúng trên ñĩa thạch (thạch petri). Các bước chuẩn bị:
+ Pha loãng canh trùng ñịnh ñếm từ hệ số thấp ñến hệ số cao từ 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000....
+ Lấy ống hút vô trùng, hút mỗi nồng ñộ pha loãng 0,1 ml nhỏ vào ñĩa thạch petri ñã chuẩn bị sẵn, mỗi nồng ñộ cấy vào 3– 5 ñĩa thạch, dùng que thủy tinh thước thợ dàn mỏng ñều trên ñĩa thạch, hoặc nghiêng ñi, nghiêng lại ñể 0,1 ml canh trùng ñược dàn ñều trên mặt thạch.
+ Cấy xong ñánh dấu ñộ pha loãng ở từng ñĩa thạch và ñể trong tủ ấm 370c. + Sau 24h ñem ñĩa thạch ra ñếm số khuẩn lạc mọc trên mặt thạch, ñếm tổng số khuẩn lạc của 3– 5 ñĩa thạch cùng một nồng ñộ, sau ñó lấy số trung bình. Nhân số lượng khuẩn lạc trung bình với 10 ñể tìm số khuẩn lạc có trong 1ml canh trùng và cuối cùng nhân với hệ số pha loãng canh trùng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………
34