2.1.1. Nguyên liệu
Viên nang mềm Ama Công được bào chế tại Xí nghiệp dược phẩm 3/2, số 10 Công Trường Quốc Tế - Quận 3 – Tp. HCM.
Thành phần:
- Mỗi viên nang mềm Ama Công có khối lượng 800 mg, trong đó: - Bột cao khô Ama Công: 150mg.
- Tá dược: lecithin 30 mg, sáp ong vàng 17mg, dầu cọ 300mg, dầu đậu nành 303mg.
Hình thức cảm quan: viên nang mềm, màu xanh lá đậm, mùi thơm vani, bên trong chứa chất lỏng hơi sánh, màu nâu đen, mùi thơm dược liệu, vị đắng nhẹ.
Đạt các chỉ tiêu về độ đồng đều về khối lượng, độ rã, độ bền cơ học, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính và định lượng theo tiêu chuẩn DĐVN III và TCCS.
2.1.2. Đối tượng
Chuột cống trắng chủng Wistar trưởng thành, 20-25 tuần tuổi, khỏe mạnh, cả hai giống, cân nặng trung bình chuột đực từ 250-300g, chuột cái 200-250g, do Học viện Quân Y cung cấp, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm. Tất cả các động vật trên được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn, nước uống, độ ẩm, độ thông khí và ánh sáng thích hợp tại khu nghiên cứu động vật thực nghiệm bộ môn Dược lực trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.3. Thuốc và hóa chất
- Progesteron ( chứa 25mg progesteron/1mL), do Công ty cổ phần dược và vật tư thú y (Hanvet) sản xuất.
- Oestradiol ( chứa 1500 mcg oestradiol benzoat/1mL), do Công ty cổ phần dược và vật tư thú y (Hanvet) sản xuất.
- Ampicillin: chế phẩm ampicillin 50mg do Công ty cổ phần xuất nhập khẩu y tế Domesco sản xuất.
- Ketamin: chế phẩm ketamin inresa 10ml, do công ty Solupharm GmbH Pharmazeutische Erzeugnisse sản xuất.
- Thiopental natri: chế phẩm thiopental injection BP do công ty Rotexmedica GmbH Atzneimittelwert sản xuất.
- Dung môi dầu pha progesteron và oestradiol. - Betadin & NaCl 0,9% .
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu trên chức năng sinh sản thông qua hành vi giao cấu.
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Agmo (1997) [17], cụ thể như sau:
Chuột cống trưởng thành cả 2 giống, đủ tiêu chuẩn nghiên cứu, được nhốt riêng đực - cái, 4-5 con/chuồng, nuôi ổn định trong chu kỳ sáng tối (20h00 : 8h00); đảo ngược bằng cách bật đèn sáng vào ban đêm (từ 20h00 đến 8h00) và tắt đèn vào ban ngày (từ 8h00 đến 20h00). Phòng nuôi chuột được dán giấy đen để đảm bảo môi trường giống ban đêm nhất trong khoảng thời gian từ 8h00 đến 20h00, đảm bảo môi trường thông thoáng và khí hậu thích hợp cho hoạt động giao cấu diễn ra. Việc nuôi chuột trong môi trường sáng - tối đảo ngược có ý nghĩa giúp cho việc quan sát của nghiên cứu viên được thuận lợi vào ban ngày, song vẫn đảm bảo cho hành vi tình dục của chuột diễn ra trong môi trường gần giống với môi trường sinh lý nhất.
Để chuột đực có hành vi tình dục, cần cho chuột đực tiếp xúc với chuột cái đang động dục. Do vậy, trong nghiên cứu, để có thể quan sát và đánh giá hành
vi tình dục của chuột đực, cần chủ động cắt bỏ buồng trứng của chuột cái, sau đó tạo ra một trạng thái động dục nhân tạo theo ý muốn bằng cách tiêm hormon ngoại sinh cho chuột cái trước khi ghép đôi; đồng thời giúp tránh thai cho chuột cái trong quá trình ghép đôi.
Kỹ thuật mổ cắt bỏ buồng trứng chuột cái được tiến hành như sau: gây mê chuột cái bằng cách tiêm phúc mạc dung dịch natri thiopental 2,5% với liều 40mg/kg và ketamin với liều 50mg/kg. Sau khi chuột đã mê, đặt chuột nằm sấp, dùng kéo cắt lớp da, lớp mỡ rồi đến lớp cơ lưng; dùng pank kéo lớp mỡ chứa buồng trứng ra ngoài, thắt buồng trứng bằng chỉ tự tiêu rồi cắt bỏ buồng trứng ở trên chỗ thắt. Khâu lần lượt lớp cơ, lớp mỡ rồi đến lớp da của chuột. Sát trùng vết mổ bằng povidon iod. Tất cả các dụng cụ đều được sấy tiệt trùng. Chuột được tiêm dự phòng trước phẫu thuật bằng ampicilin với liều 16mg/kg.
Sau khi mổ, chuột được nghỉ 14 ngày để hồi phục sức khỏe và được nuôi trong buồng sáng - tối đảo ngược để làm quen với môi trường nghiên cứu. Trước khi cho giao phối với chuột đực, chuột cái được gây động dục nhân tạo bằng liệu pháp hormon bằng cách tiêm dưới da dung dịch estradiol benzoat 0,25mg/kg trước khi giao phối 52 giờ và 48 giờ sau, tiêm dưới da dung dịch progesteron 2,5mg/kg. Khi cho giao phối với chuột đực, những con cái không có hành vi “chịu đực” (như uốn cong lưng khi bị kích thích) sẽ bị loại.
Trong quá trình ghép đôi đực cái quan sát các chỉ số sau:
- MF (số lần tiếp cận- Mounting Frequency): là số lần con đực nhảy lên lưng con cái trong một loạt giao cấu.
- ML (thời gian đạt đến tiếp cận- Mounting Latency): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần nhảy đầu tiên.
- IF (số lần thâm nhập âm đạo- Intromission Frequency): là số lần dương vật con đực thâm nhập vào âm đạo con cái trong một loạt giao cấu.
- IL (thời gian đạt đến thâm nhập- Intromission Latency): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần thâm nhập dương vật đầu tiên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- EL (thời gian đạt đến xuất tinh- Ejaculation Latency): là khoảng thời gian từ lần nhảy đầu tiên (hoặc thâm nhập âm đạo đầu tiên- nếu không có nhảy) đến lần xuất tinh đầu tiên.
- PEI (khoảng cách sau xuất tinh- Post Ejaculation Interval): là khoảng thời gian từ sau khi xuất tinh lần đầu đến lần nhảy hoặc thâm nhập âm đạo tiếp theo (nếu không có nhảy) để bắt đầu một loạt giao cấu mới.
- III (khoảng cách thâm nhập dương vật - Interintromission interval, III=EL/IF): là khoảng thời gian giữa các lần thâm nhập.
Hình 2.2. Diễn biến hành vi tình dục của chuột đực
Thử nghiệm kết thúc khi ghi được PEI, hoặc khi ML, IL > 15 phút; EL > 30 phút; PEI > 15 phút. Những chuột xác định được chỉ số PEI được xem là đã hoàn thành test hành vi.
Chuột đực và chuột cái được làm quen với test hành vi tình dục trong 3 đợt ghép, mỗi đợt cách nhau 7 ngày. Mục đích của 3 đợt làm quen này nhằm khởi động phản xạ tình dục, phát huy tối đa vai trò của hệ thần kinh và nội tiết đối với hành vi tình dục của chuột, đồng thời giúp các nghiên cứu viên làm quen
Gặp
nhau Nhảy 1 Nhảy 2
Thâm nhập 2 Xuất tinh Nhảy mới hoặc thâm nhập mới Thâm nhập 1 IL PEI III ML EL
với việc quan sát hành vi tình dục ở chuột. Sau đó chuột tiếp tục được quan sát hành vi trong 4 đợt nữa (4 test sàng lọc) để đánh giá khả năng tình dục, kết quả của 4 đợt này có ý nghĩa đánh giá khả năng hoạt động tình dục của mỗi chuột, trên cơ sở đó phân loại chuột theo khả năng hoạt động tình dục và chia đều ngẫu nhiên vào các lô nghiên cứu cụ thể như sau:
Lô 1: uống NaCl 0,9% với thể tích 10mL/kg.
Lô 2: uống chế phẩm Ama Công với liều 20,63 mg/kg.
Lô 3: uống chế phẩm Ama Công với liều 41,25 mg/kg.
Chuột được dùng thuốc liên tục 7 ngày, được ghép đôi với chuột cái 2 lần trong suốt quá trình dùng thuốc (sau khi dùng liều đầu tiên 2 giờ và ngày cuối cùng uống thuốc). Quan sát lại hành vi tình dục, ghi lại các thông số và so sánh kết quả ở lô dùng thuốc với lô chứng. Trọng lượng cơ thể chuột cũng được kiểm tra thường xuyên vào lúc bắt đầu thí nghiệm, giữa thí nghiệm, trước và sau khi dùng thuốc để đánh giá tình trạng sức khỏe chung của chuột.
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu hành vi tình dục ở chuột cống trắng (E2: tiêm estradiol benzoate; Pro: tiêm progesteron)
Ngày cuối cùng, giết chuột, lấy máu định lượng nồng độ testosteron để so sánh giữa các nhóm với nhau.
Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 Đợt 4 Đợt 5 Đợt 6 Đợt 7 Đợt 8 Đợt 9
Ngày Thiến chuột
cái E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2 E2
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro E2 giết
Để đảm bảo hoạt động giao cấu của chuột diễn ra tự nhiên và không bị ảnh hưởng bởi người quan sát, quá trình quan sát được diễn ra như sau:
Chuẩn bị 6 chuồng trấu khô, sạch, có kích thước 60 x 40 x 40 (cm), nắp chuồng là một tấm lưới inox sạch, có khe hở, đảm bảo cho chuồng quan sát được thông khí và có thể ghi lại được các hoạt động giao cấu diễn ra bên trong.
Chuẩn bị 6 webcam chất lượng cao để đảm bảo quay không bị rung giật, treo cố định phía trên mỗi chuồng quan sát sao cho ghi lại được toàn bộ diễn biến xảy ra trong chuồng.
Chuẩn bị 1 máy tính bàn được nối với các webcam, sử dụng phần mềm có thể quan sát được hình ảnh từ cả 6 webcam; có dung lượng đủ lớn để lưu giữ được ít nhất 35 hình động (trung bình 01 hình động diễn ra trong 30 phút có dung lượng có dung lượng khoảng 500MB).
Chuẩn bị danh sách chuột và các mảnh giấy nhỏ để ghi ký hiệu cặp quan sát, đảm bảo các dữ liệu ghi được là chính xác của từng cặp quan sát tương ứng.
Toàn bộ quá chuẩn bị phải được kết thúc trước khi quan sát ít nhất 10 phút.
- Tiến hành quan sát:
Lần lượt lấy chuột đực ở từng lô nghiên cứu cho vào chuồng quan sát, để tờ giấy ghi ký hiệu mã chuột đực bên cạnh chuồng.
Để 5 phút cho chuột đực làm quen với chuồng quan sát. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lần lượt thả vào mỗi chuồng chuột đực 01 chuột cái đã động dục. Ghi mã chuột cái vào bên cạnh mã chuột đực, bật máy quay ngay vào thời điểm thả chuột cái và để tờ giấy ghi mã chuột lên nắp chuồng trong 5 giây (đảm bảo mã chuột đã được lưu lại trong máy quay).
Toàn bộ quá trình giao cấu của chuột được ghi lại tự động bằng webcam có nối với máy tính trong khoảng thời gian 30 phút.
Nhân lực phục vụ cho quá trình quan sát : để phục vụ cho mỗi buổi quan sát (35 chuột), cần khoảng 2-3 người, trong đó 1-2 người bắt chuột và đọc ký hiệu chuột, 1người phụ trách máy tính.
Trong quá trình diễn ra hoạt động giao cấu của chuột, toàn bộ nghiên cứu viên ra khỏi phòng quan sát, chỉ để lại 1 người làm nhiệm vụ theo dõi hoạt động của máy tính.
- Đọc và xử lý kết quả:
Kết thúc mỗi buổi quan sát, toàn bộ dữ liệu được chuyển về máy tính chính, lưu giữ trong một folder riêng, với tên folder chính là ngày quan sát tương ứng.
Hai nghiên cứu viên chính quan sát hành vi giao cấu một cách độc lập (qua máy tính), ghi lại kết quả trong phiếu theo dõi hành vi và so sánh với nhau, với những kết quả không trùng nhau thì cả 2 cùng quan sát và thống nhất.
Kết quả thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2007, đảm bảo với mỗi lô nghiên cứu, khả năng giao cấu của chuột là tương đối đông đều.
2.3. Xử lý kết quả
Các số liệu được xử lý theo phần mềm Microsoft excel 2007, sử dụng thuật toán t-test student để so sánh giá trị trung bình. Các số liệu được trình bày dưới dạng MEAN ± SE, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ
3.1. Tác dụng trên chức năng sinh dục thông qua hành vi giao cấu 3.1.1. Kết quả hoàn thành test hành vi giao cấu qua các đợt tập luyện 3.1.1. Kết quả hoàn thành test hành vi giao cấu qua các đợt tập luyện
Chuột đực được trải qua các đợt tập luyện để làm quen với test hành vi giao cấu.
Bảng 3.1. Khả năng hoàn thành test hành vi giao cấu của chuột theo các đợt ghép cặp Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 Đợt 4 Đợt 5 Đợt 6 Đợt 7 Tổng Số chuột hoàn thành 6 13 16 18 18 21 21 35 Tỷ lệ số chuột hoàn thành(%) 17,14 37,14 45,71 51,43 51,43 60 60 100% Nhận xét:
Số chuột hoàn thành test hành vi giao cấu tăng lên qua các đợt, có sự dao động lớn về số chuột hoàn thành test hành vi giao cấu ở các đợt tập luyện 1, 2 và 3; ở các đợt 4,5,6,7 tỉ lệ chuột hoàn thành hành vi giao cấu đã ổn định. Trong nghiên cứu hành vi tình dục, trước khi thử thuốc chuột cần được ghép cặp qua 7 đợt trong đó 3 đợt đầu (1,2,3) là 3 đợt để chuột làm quen với
test hành vi và khởi động phản xạ tình dục, 4 đợt sau (4,5,6,7) được dùng để đánh giá khả năng tình dục của chuột. Kết quả hoàn thành các đợt ghép cặp 4,5,6,7 của chuột được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Số chuột hoàn thành các test hành vi giao cấu
Số chuột hoàn thành test hành vi giao cấu Lô 3 đợt 2 đợt 1 đợt 0 đợt Tổng 1 3 1 1 4 9 2 4 2 0 3 9 3 3 2 1 3 9 Tổng 10 5 2 10 27 Nhận xét:
Số chuột hoàn thành cả 4 test hành vi giao cấu (4,5,6,7) chỉ chiếm khoảng 22,85% (8 trường hợp), còn lại 27 chuột không hoàn thành ít nhất 1 test hành vi được chia đều thành 3 lô nghiên cứu theo khả năng giao cấu.
3.1.2. Tác dụng của bài thuốc lên hành vi giao cấu của chuột
Tác dụng của bài thuốc lên các chỉ số ML, IL
Các chỉ số ML (thời gian đạt đến tiếp cận) và IL (thời gian đạt đến thâm nhập) là những chỉ số được dùng để đánh giá sự ham muốn của chuột.
Bảng 3.3. Tác dụng của bài thuốc lên các chỉ số ML và IL
NaCl 0,9% Ama Công 20,63mg/kg Ama Công 41,25mg/kg Trước uống thuốc 43,25 ± 15,17 17,70±8,86 10,56±2,76 Sau UT 2 giờ 54,33±33,25 29,60±12,95 50,13±19,93 ML(giây) Sau UT 7 ngày 145,71±56,13 94,88±45,36 169,00±63,38 Trước uống thuốc 242,57±71,23 88,25±29,68 198,00±112,69 Sau UT 2 giờ 216,11±116,5 66,00±24,70 170,75±54,07 IL(giây) Sau UT 7 ngày 218,71±65,90 160,22±35,57 319,00±133,22 Nhận xét:
- Ama Công liều 20,63mg/kg và 41,25mg/kg chưa làm thay đổi các chỉ số ML và IL một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sau 2 giờ hay 7 ngày dùng thuốc.
Tác dụng của bài thuốc lên các chỉ số IF và EL
Chỉ số IF (số lần thâm nhập âm đạo) gắn liền với hoạt động của dương vật, là tiền đề cho hiện tượng xuất tinh và phản ánh hiệu quả giao cấu hơn là sự ham muốn tình dục; EL là thời gian đạt đến xuất tinh.
Bảng 3.4. Tác dụng của bài thuốc lên các chỉ số IF và EL
NaCl 0,9% Ama Công 20,63mg/kg Ama Công 41,25mg/kg Trước uống thuốc 9,14±0,80 9,70±1,43 10,67±1,58 Sau UT 2 giờ 9,67±1,99 11,40±1,40 9,63±3,02 IF (lần) Sau UT 7 ngày 11,86±1,66 10,20±1,50 7,44±1,36 Trước uống thuốc 875,43±112,94 599,57±15,59 977,77±171,58 Sau UT 2 giờ 1098,57±173,64 806,14±209,36 731,83±162,12 EL (giây) Sau UT 7 ngày 1112,00±254,97 1014,33±153,72 545,50±150,10 Nhận xét:
- Ama Công liều 20,63mg/kg và 41,25mg/kg thể trọng chuột cống chưa làm thay đổi các chỉ số IF và EL một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sau 2 giờ hay 7 ngày dùng thuốc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tác dụng của bài thuốc lên các chỉ số PEI và III
Khoảng cách sau xuất tinh (PEI) là khoảng thời gian để chuột hồi sức lại sau mỗi loạt giao cấu cũng là một chỉ số đánh giá sự ham muốn tình
dục; khoảng cách thâm nhập dương vật III (=EL/IF) vừa phản ánh hiệu quả giao cấu vừa phản ánh ham muốn tình dục.
Bảng 3.5. Tác dụng của bài thuốc lên các chỉ số PEI và III
NaCl 0,9% Ama Công 20,63mg/kg Ama Công 41,25mg/kg Trước uống thuốc 442,57 ± 24,49 380,71 ±11,93 423,00 ± 26,63 Sau UT 2 giờ 412,57 ± 11,34 383,86 ± 16,39 (↑0,82%) pt-s <0,05 449,17 ± 31,81 PEI (giây) Sau UT 7 ngày 439,75 ± 19,42 428,83 ± 17,36 442,75 ± 39,99 Trước uống thuốc 105,85 ± 21,89 65,52 ± 10,39 99,25 ± 32,05 Sau UT 2 giờ 137,30 ± 50,44 84,46 ± 25,18 (↑28,91%) Pt-s <0,05 113,01 ± 20,47 III (giây) Sau UT 7 ngày 84,64 ± 27,37 116,09 ± 26,79 57,02 ± 9,38 Nhận xét:
- Ama Công liều 20,63mg/kg thể trọng chuột cống làm tăng cả chỉ số PEIvà III sau 2 giờ dùng thuốc một cách có ý nghĩa thống kê.
- Ama Công liều 40,25mg/kg thể trọng chuột cống chưa làm thay đổi các
chỉ số PEI và III một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
3.2. Tác dụng của thuốc lên nồng độ testosteron máu
Nồng độ testosteron máu (nmol/L)
Biểu đồ 3.6.Sự thay đổi của testosteron máu dưới tác dụng của Ama Công liều 20,63mg/kg và 41,25mg/kg trong nghiên cứu hành vi giao cấu ở chuột cống đực